Улавливание кашля как портал в легкие (CC1)

Гипотеза: кашель может служить надежным неинвазивным заменителем легких для больших молекул, таких как ДНК и белки, потенциально для различных клинических целей и целей общественного здравоохранения.

Кратко о предложении: для разработки эпидемиологической и клинически применимой платформы для крупных молекул, захваченных уникальным образом из глубоких отделов легких, исследовательская группа будет использовать новый подход, который включает сбор образцов кашля и тестирование эффективности и практичности разделения образцов кашля для исследования глубоких отделов легких. специфические внеклеточные везикулы (ВВ). Этот образец от кашля будет сравниваться с образцом из инвазивно собранных глубоких образцов легких, БАЛ/бронхиальных щеток, а также с потенциально загрязняющим ополаскивателем для рта у одних и тех же людей. Исследовательская группа первоначально предлагает изучить эти сырые образцы кашля, а затем образцы разделенных EV дыхательных путей на соматические мутации с помощью массового секвенирования SMM для соматических мутаций, современных методов, разработанных в лабораториях Вийга / Маслова, и для белков, которые, как известно, являются специфическими. для легкого, в отличие от полости рта/слюны, в ядре Сидоли/протеомики.

Конкретные цели:

1. Кашель будет захвачен аэрокамерой или эквивалентным/оптимизированным устройством у 5 здоровых добровольцев и у 5 нынешних курильщиков, параллельно с полосканием рта и БАЛ. Легочные EV из этих же образцов с помощью глубокого захвата легких (лаборатория Loudig) будут выполняться параллельно.
2. Кашель будет подвергаться анализу мутаций ДНК с использованием секвенирования мутаций одной молекулы (SMM-seq).
3. Кашель, жидкость для полоскания рта и БАЛ будут подвергаться протеомному анализу с использованием ЖХ-МС в нашем основном центре.

Подход:

Практика протокола исследований легких человека в целом: Текущее зачисление субъектов является частью давнего одобренного IRB клинического протокола Эйнштейна-Монтефиоре (2007-407). К участию допускаются лица из пульмонологических клиник: возраст > 21 года, любой статус курения, множество сопутствующих заболеваний, за исключением противопоказаний к БАЛ, запланированная клинически показанная процедура забора легких (бронхоскопия) в рамках рутинной помощи. Это составляет >100-150 бронхоскопических и связанных с ними доноров-бывших курильщиков в год. Более 150-200 таких ранее существовавших наборов бронхоскопических образцов и сопутствующего неинвазивного EBC, наряду с MW, буккальной щеткой и другими] сохранены и потенциально доступны для текущего исследования. Все данные/образцы собираются перед диагностикой и процедурой; каждый субъект предоставляет образцы EBC (и другие неинвазивные исследования, такие как кашель) перед бронхоскопией. Таким образом, этот активный протокол сводит к минимуму (i) систематическую ошибку припоминания; и (ii) загрязнение неинвазивных образцов из-за разрывов и вытекания легочной ткани, присущих этим процедурам на легких. За каждым субъектом будут следить в течение 3 месяцев в медицинской документации, чтобы собрать обновленную диагностику / тестирование и свести к минимуму ошибочную классификацию случай-контроль. Имеются обширные демографические, экспозиционные и клинические данные: (1) демографическая информация; (2) сведения о курении: (3) маркеры основного заболевания легких: (4) существующая визуализация (5) клиническая информация/патологические данные. Для этого экспериментального проекта МУТР:

1. Цель 1: Кашель будет зафиксирован у 5 здоровых добровольцев и у 5 нынешних курильщиков до проведения бронхоскопии. Также будут собраны образцы БАЛ для исследований и ополаскивателя для рта. Специфические для легких электромобили из этих образцов с помощью глубокого захвата легких (лаборатория Loudig) будут выполняться параллельно.

Кашель будет фиксироваться в аэрокамере (обычное одноразовое ручное дистанционное устройство для ингаляторов/насосов с измерителем астмы). Группа исследователей обнаружила, что это адекватное устройство для захвата кашля (форсированного выдоха), ожидающее дальнейшей оптимизации. Согласно запланированной поправке, пациент должен кашлять каждые 30 секунд в переносную пластиковую камеру в течение 10 минут. Все внутренние поверхности всей камеры затем ополаскивают 2-4 мл PBS, и раствор для полоскания/промывки быстро замораживают. Затем промывку обрабатывают в соответствии с исследуемым аналитом. Для ДНК предусмотрен этап преципитации изопропанолом/этанолом с последующим ресуспендированием в меньшем объеме и экстракцией с помощью набора для выделения ДНК Qiagen/Zymo. Что касается белка, неочищенный экстракт в PBS обрабатывается непосредственно в сердцевине путем осаждения, сушки, ресуспендирования в буфере и инъекции в платформу ЖХ-МС для дробового анализа.

Опубликована процедура разделения EV. EV-CATCHER™ можно настроить для нацеливания на уникальные белки поверхностной мембраны, характерные для желаемого типа клеток, и, таким образом, для прямого захвата специфичных для клеток EV. Лаборатория Loudig собрала обширные данные, демонстрирующие, например, что использование антител, нацеленных на уникальные и специфические белки глубоких клеток легкого (например, специфический белок клеток Clara (CCSP), поверхностно-активный белок клеток альвеолярного типа 2 (SFTPC)) может специфически очищать EV. из бронхоальвеолярного лаважа (BAL) и конденсата выдыхаемого воздуха (EBC) и получают сходные профили экспрессии микроРНК. Наконец, путем добавления ферментативно разлагаемого урацилированного двухцепочечного линкера, меченного биотином, между иммобилизирующей платформой (полистирольный 96-луночный планшет) и активированным антителом можно облегчить интактное высвобождение иммуноочищенных EV путем инкубации с урацилгликозилазой (UNG).

Подход: аликвоты от 10 первоначальных доноров, предоставивших образцы от кашля, ополаскивателя для рта и БАЛ (5 нынешних курильщиков, 5 никогда не куривших), всего 30 первоначальных образцов среди всех типов образцов для разделения ЭВ. Затем будут созданы как целые неразделенные, так и EV-разделенные образцы (всего 60 образцов), которые будут отсортированы для двух основных анализов, SMM для соматической мутации и протеомики дробовика, как для демонстрации осуществимости, так и для пилотной оценки суррогатного материнства. кашель для легких.

Цель 2: Кашель будет подвергаться анализу мутаций ДНК с использованием SMM. Прямой анализ целостности последовательности генома в нормальных клетках. Ключевой проблемой при изучении целостности последовательности генома в нормальных тканях человека является случайный характер мутаций ДНК в геноме. В то время как некоторые мутации клонально амплифицируются, подавляющее большинство из них уникальны для каждой клетки и, следовательно, являются редкими и вариантными, что требует либо амплификации всего генома одной клетки, либо анализов клональной амплификации in vitro. Оба подхода были связаны с артефактами. Недавно лаборатория Маслова/Вейга разработала надежные методы количественной оценки соматических мутаций в одиночных клетках или в клонально амплифицированных одиночных клетках. С помощью этих методов было продемонстрировано, что мутации замещения оснований увеличиваются с курением (и возрастом) в базальных клетках проксимального бронхиального эпителия. Более новый метод количественного анализа соматических мутаций, Single Molecule Mutation-seq (SMM-seq), намного более экономичен и может применяться к небольшим количествам объемной ДНК. Этот новейший метод SMM-seq имеет важное значение, поскольку он позволяет, помимо прочего, использовать практические средства для точного обнаружения мутаций в цитологически нормальных клетках.

Подход: 20 образцов кашля (10 нефракционированных, 10 фракционированных) будут подвергнуты выделению ДНК, подготовке библиотеки и секвенированию, как описано в протоколе. Соматические мутации среди всех обнаруженных вариантов происходят путем вычитания полиморфизмов зародышевой линии, обнаруженных при анализе регулярной библиотеки секвенирования из ДНК того же человека. Количество соматических вариантов нормируется на количество вызываемых оснований, т. е. оснований с покрытием более 7Х в библиотеках SMM-seq и с покрытием более 20Х в обычных библиотеках. Частота соматических мутаций будет выражаться количеством мутаций на геном. Остальные 40 проб (20 из жидкости для полоскания рта и 20 из БАЛ) будут обработаны в рамках других текущих механизмов финансирования с учетом бюджетных ограничений.

Цель 3: Кашель, жидкость для полоскания рта и БАЛ будут подвергнуты протеомному анализу с использованием ЖХ-МС в центре Эйнштейна. Насколько известно исследователям, предыдущих попыток протеомики при кашле не существовало, возможно, из-за технических ограничений материала с низким содержанием. Ядро протеомики (Sidoli, et al) оптимизирует стратегию повышения чувствительности и скорости количественного определения белков/пептидов с низким содержанием. Протокол подготовки образцов будет изменен, чтобы свести к минимуму потери образцов и миниатюризировать наножидкостную хроматографию в сочетании с современной МС для количественного определения белков/пептидов в образцах BAL, MW и EBC.

Подход: подготовка образцов для протеомики: образец кашля высушивают до полного завершения, а затем ресуспендируют в 5 мкл 50 мМ бикарбоната аммония (pH = 8) для канонической подготовки образцов протеомики (20 нг трипсина). Затем весь образец анализируется с использованием наножидкостного хроматографа Dionex RSLC Ultimate 300 (Thermo Scientific), соединенного в режиме онлайн с масс-спектрометром Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Для разделения в лаборатории будет использоваться набивная аналитическая колонка собственного производства с минимальным внутренним диаметром (внутренний диаметр 50 мкм, длина 25 см), чтобы можно было разделить молекулы со скоростью потока ~100 нл/мин. Низкая скорость потока обеспечивает повышенную предварительную концентрацию образца, элюирующегося из колонки, что приводит к субаттомольной чувствительности.

Анализ данных, включая преобразование данных, затем выполняется с использованием конвейера в лаборатории Sidoli. Вкратце, спектры протеомной МС идентифицируются и количественно оцениваются с использованием Proteome Discoverer (v2.5, Thermo Scientific) с более строгими пороговыми значениями, чем в настоящее время рекомендовано сообществом для уровня ложных открытий (<1% FDR для совпадений спектра, пептидов и белков). Затем количественные значения преобразуются и нормализуются, как описано в лаборатории Sidoli. Статистическую регуляцию оценивают с помощью параметрической статистики (p<0,05). Хроматограммы проверяются вручную, учитывая относительно короткий список кандидатов.

Все образцы от кашля (10 нефракционированных, 10 фракционированных x 3 типа образцов = 60 образцов) будут подвергаться протеомному анализу, как описано.

Межкомпартментные сравнения: Определение суррогатного материнства кашля для легкого может быть выполнено аналогично тому, как это делается для суррогатного материнства EBC для легкого. В рамках данной платформы будут сравниваться уровни (и сигнатура) мутации SMM. В недавнем прошлом в выдыхаемой среде микроРНК (здесь не предлагается) это было выполнено с помощью корреляций Спирмена кластеризации данных микроРНК-seq в основных компонентах, PCA (не показано) и корреляций Спирмена (не показано). Для среды протеомики этот суррогат кашля для легких может быть показан для кашля аналогичным образом с помощью кластеризации тепловых карт, PCA и таких методов, как корреляция Спирмена.

Результат: это первоначальное экспериментальное тестирование кашля в качестве нового биообразца платформы представляет собой прагматичную трансляционную работу с высоким риском и высокой наградой. Если этот пилотный проект покажет, что кашель является допустимым заменителем легких на двух исследованных платформах, то это предоставит веские предварительные доказательства для поддержки дальнейшего федерального финансирования. Этот потенциал портала в легкие на основе дыхательных путей можно было бы предусмотреть для широкого круга острых и хронических клинических целей и целей общественного здравоохранения.