ブドウ膜黒色腫における形態学的、遺伝学的および腫瘍微小環境の特徴付け (MicroGenUM)

疾患の段階に関係なく、臨床実習のためにすでに収集され、A.ジェメッリ総合病院の病理解剖学のUOCのアーカイブに保管されているサンプルからホルマリンで固定され、パラフィンに包含された、疾患の段階に関係なく、外科標本からの組織が使用されます。研究目的でのこれらのサンプルの使用に対する患者のインフォームドコンセントが条件となります。 UOC Anatomia Patologica がアーカイブ資料 (スライド) の復元を担当します。

臨床実践によって調製される擬似匿名化スライドは、免疫組織化学分析のために、フィレンツェのアジエンダ・オスペダリエロ大学カレッジ病理組織学・分子診断研究所に送られ、以下に報告するように実施される。 次の分析が実行されると、スライドは破棄されます。

免疫組織化学分析のために、FFPE サンプルに由来する 3 μm 厚の切片が調製されます。 サンプル処理は、自動免疫染色装置 (Ventana Discovery ULTRA、Ventana Medical Systems、ツーソン、アリゾナ州) を使用して実行されます。 切片は EZ prep (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) で脱パラフィンされ、続いて Cell Conditioning 1 (CC1) バッファー (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) で処理されます。抗原の回復を促進します。 最後に、目的の染色に従って一次抗体が分注され、Ultramap 抗マウスまたは抗ウサギ検出キットを使用してシグナルが生成されます。 TME の特性評価では、サンプルは次の一次抗体で染色されます: CD3、CD4、CD8、CD68、CD163。 IHC で処理されたすべての切片は、Aperio AT2 プラットフォーム (ライカ バイオシステムズ、デラウェア州ウェッツラー) を使用してホール スライド画像 (WSI) でデジタル スキャンされます。デジタル病理学は、フィレンツェ大学で実施される予定の新しい学問です。高度に標準化されたアプローチを使用したデジタル画像の定量分析。 これにより、免疫細胞間の相互作用を定量的に測定し、それらの相対的な空間分布を特徴付けることが可能になります。 さらに、MU の TME を深く研究できるようにするさらなる情報を生成することができます。

フィレンツェ大学にある HALO 画像解析プラットフォームにより、以下が可能になります。 i) 細胞の定量化、マーキングの強度の評価、細胞区画 (核、細胞質、膜) の認識。 ii）腫瘍内および腫瘍周囲部分における細胞の相対分布の特定による空間分析。 iii) デジタル画像と一緒に生成されたデータベースの共有。

単一または複数の IHC で標識されたサンプルは、TME を構成するさまざまな細胞サブセットを特徴付けるために、この自動デジタル定量システムを使用して評価されます。 複数の免疫組織化学とデジタル解析を組み合わせることで、データが正確に解析され、新しいサインを見つけるための新しい解析ワークフローが生み出されます。 デジタル解析から得られるすべてのデータは、MU の病状における新しい予後因子を特定することを目的として、病状の進行と相関します。

細胞遺伝学的変化を特定するための分析は、臨床現場で定期的に行われているため、データがすでに入手可能であり、ジェメッリ財団遺伝学研究所の研究に登録された患者のコホート全体を対象に、新鮮な組織サンプルを使用して実施されました。臨床実践に従って手術室で撮影されます。 Agilent Technologies のオリゴヌクレオチド プラットフォーム上の Array-CGH メソッドを使用しました。 臨床実践に従って、Gentra Pure Gene 市販キット (QIAGEN) を使用して、MU サンプルからの腫瘍 DNA を抽出しました。抽出後、得られた DNA の量と純度を評価しました。 品質に適していると思われるすべてのサンプルは、Agilent Technologies が指定したプロトコルに従って処理されました。 得られたデータは、Cytogenomics ソフトウェアを使用して分析されました。 これらの分析により、腫瘍の遺伝子型の特徴を得ることができます。