Charakterystyka morfologiczna, genetyczna i mikrośrodowiska guza w czerniaku błony naczyniowej oka (MicroGenUM)

Tkanki z wycinków chirurgicznych niezależnie od stopnia zaawansowania choroby, utrwalone w formalinie i zalane parafiną z próbek już pobranych do praktyki klinicznej i przechowywanych w archiwum UOC Anatomii Patologicznej Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS zostaną wykorzystane do badania, pod warunkiem świadomej zgody pacjenta na wykorzystanie tych próbek do celów badawczych. Odzyskiwaniem materiałów archiwalnych (slajdy) zajmie się UPC Anatomia Patologica.

Pseudonimizowane szkiełka, które zostaną przygotowane w praktyce klinicznej, zostaną przesłane do Instytutu Histologii Patologicznej i Diagnostyki Molekularnej Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi we Florencji w celu analizy immunohistochemicznej, która zostanie przeprowadzona zgodnie z opisem poniżej. Po przeprowadzeniu poniższej analizy slajdy zostaną zniszczone.

Skrawki o grubości 3 μm pochodzące z próbek FFPE zostaną przygotowane do analizy immunohistochemicznej. Przetwarzanie próbek zostanie przeprowadzone przy użyciu automatycznego immunostainera (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Skrawki zostaną odparafinowane w EZ prep (nr 950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), a następnie potraktowane buforem Cell Conditioning 1 (CC1) (nr 950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) w celu promować regenerację antygenów. Wreszcie, przeciwciała pierwszorzędowe zostaną dozowane zgodnie z pożądanym wybarwieniem, a sygnał zostanie wywołany za pomocą zestawów Ultramap do wykrywania antymysich lub przeciwkróliczych. W celu scharakteryzowania TME próbki zostaną wybarwione następującymi przeciwciałami pierwotnymi: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Wszystkie skrawki przetworzone za pomocą IHC zostaną zeskanowane cyfrowo w obrazach całych slajdów (WSI) przy użyciu platformy Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). Patologia cyfrowa, która zostanie przeprowadzona na Uniwersytecie we Florencji, jest nową dyscypliną, która umożliwia ilościowa analiza obrazów cyfrowych przy użyciu wysoce wystandaryzowanych metod. Pozwoli to na ilościowe pomiary interakcji między komórkami odpornościowymi i scharakteryzowanie ich względnego rozkładu przestrzennego. Ponadto będzie w stanie generować dalsze informacje, które pozwolą na dogłębne zbadanie TME MU.

Platforma analizy obrazu HALO, obecna na Uniwersytecie we Florencji, pozwoli na: i) kwantyfikację komórek, ocenę intensywności znakowania, rozpoznawanie przedziałów komórkowych (jądro, cytoplazma, błona); ii) analiza przestrzenna poprzez identyfikację względnych rozkładów komórek w części wewnątrz- i okołoguzowej; iii) udostępnienie bazy danych wygenerowanej wraz z obrazami cyfrowymi.

Próbki oznaczone pojedynczym lub wieloma IHC zostaną ocenione przy użyciu tego zautomatyzowanego cyfrowego systemu oznaczania ilościowego w celu scharakteryzowania różnych podzbiorów komórek tworzących TME. Łącząc wiele immunohistochemii z analizą cyfrową, dane zostaną dokładnie przeanalizowane, tworząc w ten sposób nowy przepływ pracy analitycznej w celu znalezienia nowych sygnatur. Wszystkie dane uzyskane z analizy cyfrowej zostaną skorelowane z postępem patologii w celu zidentyfikowania nowych czynników prognostycznych w patologii MU.

Analizę mającą na celu identyfikację zmian cytogenetycznych, której dane są już nam dostępne, ponieważ są regularnie wykonywane w praktyce klinicznej, przeprowadzono na całej kohorcie pacjentów włączonych do badania w Instytucie Genetyki Fondazione Policlinico Gemelli na świeżych próbkach tkanek przyjmowane na sali operacyjnej zgodnie z praktyką kliniczną. Zastosowano metody Array-CGH na platformach oligonukleotydowych firmy Agilent Technologies. DNA guza z próbek MU ekstrahowano przy użyciu komercyjnego zestawu Gentra Pure Gene (QIAGEN) zgodnie z praktyką kliniczną; po ekstrakcji oceniono ilość i czystość otrzymanego DNA. Wszystkie próbki uznane za odpowiednie do jakości zostały przetworzone zgodnie z protokołem wskazanym przez Agilent Technologies. Uzyskane dane analizowano za pomocą oprogramowania Cytogenomics. Analizy te pozwolą na uzyskanie genotypowej charakterystyki guza.