Morphologische, genetische und Tumor-Mikroumgebungscharakterisierung beim Aderhautmelanom (MicroGenUM)

Gewebe aus chirurgischen Proben, unabhängig vom Stadium der Erkrankung, fixiert in Formalin und eingeschlossen in Paraffin aus Proben, die bereits für die klinische Praxis gesammelt und in den Archiven der UOC für Pathologische Anatomie der Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS aufbewahrt werden, werden verwendet der Studie, vorbehaltlich der Einwilligung des Patienten in die Verwendung dieser Proben für Forschungszwecke. Die UOC Anatomia Patologica wird sich um die Wiederherstellung des Archivmaterials (Dias) kümmern.

Die pseudoanonymisierten Objektträger, die in der klinischen Praxis erstellt werden, werden zur immunhistochemischen Analyse an das Institut für Pathologische Histologie und Molekulare Diagnostik der Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi in Florenz geschickt, die wie unten beschrieben durchgeführt wird. Sobald die folgende Analyse durchgeführt wurde, werden die Objektträger vernichtet.

Von FFPE-Proben stammende Schnitte mit einer Dicke von 3 μm werden für die immunhistochemische Analyse vorbereitet. Die Probenverarbeitung wird mit einem automatisierten Immunfärbegerät (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) durchgeführt. Die Schnitte werden in EZ prep (Nr. 950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) entparaffiniert, gefolgt von einer Behandlung mit Cell Conditioning 1 (CC1)-Puffer (Nr. 950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). fördern die Antigenwiederherstellung. Abschließend werden Primärantikörper entsprechend der gewünschten Färbung abgegeben und das Signal mit Ultramap Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-Nachweiskits entwickelt. Zur TME-Charakterisierung werden die Proben mit den folgenden Primärantikörpern gefärbt: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Alle mit IHC verarbeiteten Schnitte werden mithilfe der Aperio AT2-Plattform (Leica Biosystems, Wetzlar, DE) in Whole Slide Images (WSI) digital gescannt. Die digitale Pathologie, die an der Universität Florenz durchgeführt wird, ist eine aufstrebende Disziplin, die dies ermöglicht quantitative Analyse digitaler Bilder mit hochstandardisierten Ansätzen. Es wird quantitative Messungen der Interaktionen zwischen Immunzellen ermöglichen und deren relative räumliche Verteilung charakterisieren. Darüber hinaus können weitere Informationen generiert werden, die eine eingehende Untersuchung des TME der MU ermöglichen.

Die an der Universität Florenz vorhandene Bildanalyseplattform HALO ermöglicht: i) Zellquantifizierung, Bewertung der Intensität der Markierung, Erkennung von Zellkompartimenten (Kern, Zytoplasma, Membran); ii) räumliche Analyse durch Identifizierung der relativen Zellverteilungen im intra- und peritumoralen Teil; iii) Teilen der Datenbank, die zusammen mit den digitalen Bildern erstellt wurde.

Mit einem oder mehreren IHC markierte Proben werden mithilfe dieses automatisierten digitalen Quantifizierungssystems ausgewertet, um die verschiedenen Zelluntergruppen zu charakterisieren, aus denen sich das TME zusammensetzt. Durch die Kombination mehrerer Immunhistochemie mit digitaler Analyse werden die Daten genau analysiert und so ein neuer Analyse-Workflow für die Suche nach neuen Signaturen geschaffen. Alle aus der digitalen Analyse abgeleiteten Daten werden mit dem Fortschreiten der Pathologie korreliert, mit dem Ziel, neue prognostische Faktoren in der Pathologie von MU zu identifizieren.

Die Analyse zur Identifizierung zytogenetischer Veränderungen, deren Daten uns bereits vorliegen, da sie regelmäßig in der klinischen Praxis durchgeführt werden, wurde an der gesamten Kohorte der für die Studie eingeschriebenen Patienten am Institut für Genetik der Fondazione Policlinico Gemelli an frischen Gewebeproben durchgeführt entsprechend der klinischen Praxis im Operationssaal durchgeführt. Es kamen Array-CGH-Methoden auf Oligonukleotidplattformen von Agilent Technologies zum Einsatz. Tumor-DNA aus MU-Proben wurde mit dem kommerziellen Gentra Pure Gene-Kit (QIAGEN) gemäß der klinischen Praxis extrahiert; Nach der Extraktion wurde die Menge und Reinheit der erhaltenen DNA bewertet. Alle als qualitativ geeignet erachteten Proben wurden gemäß dem von Agilent Technologies angegebenen Protokoll verarbeitet. Die erhaltenen Daten wurden mit der Cytogenenomics-Software analysiert. Diese Analysen ermöglichen eine genotypische Charakterisierung des Tumors.