Caracterización Morfológica, Genética y Microambiente Tumoral en Melanoma Uveal (MicroGenUM)

Se utilizarán para la el estudio, sujeto al consentimiento informado del paciente para el uso de estas muestras con fines de investigación. La UOC Anatomia Patologica se encargará de la recuperación del material de archivo (diapositivas).

Los portaobjetos pseudoanonimizados, que serán preparados por la práctica clínica, se enviarán al Instituto de Histología Patológica y Diagnóstico Molecular de la Azienda Ospedaliero- Universitaria Careggi, Florencia, para el análisis inmunohistoquímico, que se llevará a cabo como se indica a continuación. Una vez realizado el siguiente análisis, los portaobjetos serán destruidos.

Se prepararán secciones de 3 μm de espesor derivadas de muestras FFPE para análisis inmunohistoquímico. El procesamiento de muestras se realizará utilizando un inmunoteñidor automatizado (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Las secciones se desparafinarán en EZ prep (n.º 950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), seguido de un tratamiento con tampón Cell Conditioning 1 (CC1) (n.º 950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) para promover la recuperación antigénica. Finalmente, se dosificarán los anticuerpos primarios según la tinción deseada y se desarrollará la señal con los kits de detección Ultramap anti-ratón o anti-conejo. Para la caracterización de TME, las muestras se tiñerán con los siguientes anticuerpos primarios: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Todas las secciones procesadas con IHC se escanearán digitalmente en Whole Slide Images (WSI) utilizando la plataforma Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). La Patología Digital, que se realizará en la Universidad de Florencia, es una disciplina emergente que permite la análisis cuantitativo de imágenes digitales utilizando enfoques altamente estandarizados. Permitirá mediciones cuantitativas de las interacciones entre células inmunitarias y caracterizará su distribución espacial relativa. Además, podrá generar más información que permitirá profundizar en el TME de la UM.

La plataforma de análisis de imágenes HALO, presente en la Universidad de Florencia, permitirá: i) cuantificación celular, evaluación de la intensidad del marcado, reconocimiento de compartimentos celulares (núcleo, citoplasma, membrana); ii) análisis espacial a través de la identificación de las distribuciones relativas de células en la porción intra y peritumoral; iii) compartir la base de datos generada junto con las imágenes digitales.

Las muestras etiquetadas con IHC simple o múltiple se evaluarán utilizando este sistema de cuantificación digital automatizado para caracterizar los diversos subconjuntos de células que componen el TME. Al combinar la inmunohistoquímica múltiple con el análisis digital, los datos se analizarán con precisión, produciendo así un nuevo flujo de trabajo de análisis para encontrar nuevas firmas. Todos los datos derivados del análisis digital serán correlacionados con la evolución de la patología, con el objetivo de identificar nuevos factores pronósticos en la patología de la UM.

El análisis para la identificación de alteraciones citogenéticas, cuyos datos ya están disponibles porque se realizan regularmente en la práctica clínica, se realizó en toda la cohorte de pacientes inscritos para el estudio en el Instituto de Genética de la Fondazione Policlinico Gemelli en muestras de tejido fresco. tomadas en el quirófano según la práctica clínica. Se utilizaron métodos de matriz-CGH en plataformas de oligonucleótidos de Agilent Technologies. El ADN tumoral de las muestras de MU se extrajo con el kit comercial Gentra Pure Gene (QIAGEN) según la práctica clínica; una vez extraído se evaluó la cantidad y pureza del ADN obtenido. Todas las muestras consideradas aptas para la calidad fueron procesadas siguiendo el protocolo indicado por Agilent Technologies. Los datos obtenidos se analizaron utilizando el software Cytogenomics. Estos análisis permitirán obtener una caracterización genotípica del tumor.