Caratterizzazione morfologica, genetica e del microambiente tumorale nel melanoma uveale (MicroGenUM)

Tessuti provenienti da campioni chirurgici indipendentemente dallo stadio della malattia, fissati in formalina e inclusi in paraffina da campioni già raccolti per la pratica clinica e conservati presso l'archivio della UOC di Anatomia Patologica della Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS saranno utilizzati per lo studio, previo consenso informato del paziente all'uso di questi campioni per scopi di ricerca. La UOC Anatomia Patologica si occuperà del recupero del materiale d'archivio (vetrini).

I vetrini pseudoanonimizzati, che saranno predisposti dalla pratica clinica, saranno inviati all'Istituto di Istologia Patologica e Diagnostica Molecolare dell'Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Firenze per l'analisi immunoistochimica, che sarà effettuata come di seguito riportato. Una volta eseguita la seguente analisi, i vetrini verranno distrutti.

Sezioni di 3 μm di spessore derivate da campioni FFPE saranno preparate per l'analisi immunoistochimica. L'elaborazione dei campioni verrà eseguita utilizzando un immunocoloratore automatico (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Le sezioni saranno deparaffinate in preparazione EZ (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), seguita dal trattamento con tampone Cell Conditioning 1 (CC1) (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) al fine di promuovere il recupero antigenico. Infine, gli anticorpi primari saranno dispensati in base alla colorazione desiderata e il segnale sarà sviluppato con i kit di rilevamento Ultramap anti-topo o anti-coniglio. Per la caratterizzazione della TME, i campioni saranno colorati con i seguenti anticorpi primari: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Tutte le sezioni elaborate con IHC saranno scansionate digitalmente in Whole Slide Images (WSI) utilizzando la piattaforma Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). La patologia digitale, che sarà svolta presso l'Università di Firenze, è una disciplina emergente che consente la analisi quantitativa di immagini digitali utilizzando approcci altamente standardizzati. Consentirà misurazioni quantitative delle interazioni tra le cellule immunitarie e caratterizzerà la loro relativa distribuzione spaziale. Inoltre, sarà in grado di generare ulteriori informazioni che consentiranno di approfondire il TME della MU.

La piattaforma di analisi delle immagini HALO, presente presso l'Università di Firenze, consentirà: i) la quantificazione cellulare, la valutazione dell'intensità della marcatura, il riconoscimento dei compartimenti cellulari (nucleo, citoplasma, membrana); ii) analisi spaziale attraverso l'identificazione delle relative distribuzioni di cellule nella porzione intra e peri-tumorale; iii) condivisione del database generato insieme alle immagini digitali.

I campioni marcati con IHC singolo o multiplo saranno valutati utilizzando questo sistema di quantificazione digitale automatizzato al fine di caratterizzare i vari sottoinsiemi cellulari che compongono il TME. Combinando l'immunoistochimica multipla con l'analisi digitale, i dati verranno analizzati accuratamente, producendo così un nuovo flusso di lavoro di analisi per trovare nuove firme. Tutti i dati derivati ​​dall'analisi digitale saranno correlati con la progressione della patologia, con l'obiettivo di identificare nuovi fattori prognostici nella patologia della MU.

L'analisi per l'identificazione delle alterazioni citogenetiche, i cui dati sono già a nostra disposizione in quanto regolarmente eseguiti nella pratica clinica, è stata condotta sull'intera coorte di pazienti arruolati per lo studio presso l'Istituto di Genetica della Fondazione Policlinico Gemelli su campioni di tessuto fresco prelevato in sala operatoria come da pratica clinica. Sono stati utilizzati metodi Array-CGH su piattaforme oligonucleotidiche di Agilent Technologies. Il DNA tumorale dai campioni di MU è stato estratto utilizzando il kit commerciale Gentra Pure Gene (QIAGEN) come da pratica clinica; una volta estratto, è stata valutata la quantità e la purezza del DNA ottenuto. Tutti i campioni ritenuti idonei per la qualità sono stati processati seguendo il protocollo indicato da Agilent Technologies. I dati ottenuti sono stati analizzati utilizzando il software Cytogenomics. Queste analisi permetteranno di ottenere una caratterizzazione genotipica del tumore.