Karakterisering av morfologisk, genetisk och tumörmikromiljö vid uveal melanom (MicroGenUM)

Vävnader från kirurgiska prover oavsett sjukdomsstadium, fixerade i formalin och inkluderade i paraffin från prover som redan samlats in för klinisk praxis och som förvaras i arkiven hos UOC of Pathological Anatomy of the Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS kommer att användas för studien, med förbehåll för patientens informerade samtycke till användningen av dessa prover för forskningsändamål. UOC Anatomia Patologica kommer att ta hand om återvinningen av arkivmaterial (slides).

De pseudoanonymiserade objektglasen, som kommer att förberedas av klinisk praxis, kommer att skickas till Institutet för patologisk histologi och molekylär diagnostik vid Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Florens för immunhistokemisk analys, som kommer att utföras enligt nedan. När följande analys har utförts kommer objektglasen att förstöras.

Sektioner med 3 μm tjocklek härledda från FFPE-prover kommer att förberedas för immunhistokemisk analys. Provbearbetning kommer att utföras med hjälp av en automatisk immunfärgare (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Sektioner kommer att avparaffineras i EZ prep (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), följt av behandling med Cell Conditioning 1 (CC1) buffert (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) för att främja antigenisk återhämtning. Slutligen kommer primära antikroppar att dispenseras enligt önskad färgning och signalen kommer att utvecklas med Ultramap anti-mus eller anti-kanin detektionskit. För TME-karakterisering kommer proverna att färgas med följande primära antikroppar: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Alla sektioner som bearbetas med IHC kommer att skannas digitalt i Whole Slide Images (WSI) med hjälp av Aperio AT2-plattformen (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). Digital Pathology, som kommer att utföras vid University of Florence, är en framväxande disciplin som tillåter kvantitativ analys av digitala bilder med hjälp av högt standardiserade metoder. Det kommer att möjliggöra kvantitativa mätningar av interaktionerna mellan immunceller och karakterisera deras relativa rumsliga fördelning. Dessutom kommer den att kunna generera ytterligare information som gör det möjligt att studera MU:s TME på djupet.

HALO-bildanalysplattformen, närvarande vid universitetet i Florens, kommer att möjliggöra: i) cellkvantifiering, utvärdering av intensiteten av markeringen, igenkänning av cellkompartment (kärna, cytoplasma, membran); ii) rumslig analys genom identifiering av de relativa fördelningarna av celler i intra- och peritumördelen; iii) delning av databasen som genereras tillsammans med de digitala bilderna.

Prover märkta med en eller flera IHC kommer att utvärderas med detta automatiserade digitala kvantifieringssystem för att karakterisera de olika cellundergrupperna som utgör TME. Genom att kombinera multipel immunhistokemi med digital analys kommer data att analyseras noggrant, vilket skapar ett nytt analysarbetsflöde för att hitta nya signaturer. All data som härrör från den digitala analysen kommer att korreleras med utvecklingen av patologin, i syfte att identifiera nya prognostiska faktorer i patologin för MU.

Analysen för identifiering av cytogenetiska förändringar, vars data redan är tillgängliga för oss eftersom de regelbundet utförs i klinisk praxis, utfördes på hela kohorten av patienter som registrerades för studien vid Genetics Institute of Fondazione Policlinico Gemelli på färska vävnadsprover tas på operationssalen enligt klinisk praxis. Array-CGH-metoder på oligonukleotidplattformar från Agilent Technologies användes. Tumör-DNA från MU-prover extraherades med användning av Gentra Pure Gene kommersiella kit (QIAGEN) enligt klinisk praxis; när det väl extraherats utvärderades mängden och renheten av erhållet DNA. Alla prover som ansågs lämpliga för kvalitet bearbetades enligt det protokoll som anges av Agilent Technologies. Erhållna data analyserades med användning av Cytogenomics-mjukvara. Dessa analyser kommer att möjliggöra en genotypisk karakterisering av tumören.