葡萄膜黑色素瘤的形态学、遗传学和肿瘤微环境特征 (MicroGenUM)

来自手术标本的组织，无论疾病的阶段如何，固定在福尔马林中，并包含在石蜡中，这些样本来自已经为临床实践收集的样本，并保存在 Fondazione Policlinico Universitario A 病理解剖 UOC 的档案中。Gemelli IRCCS 将用于研究，但须征得患者的知情同意，才能将这些样本用于研究目的。 UOC Anatomia Patologica 将负责恢复档案材料（幻灯片）。

将由临床实践准备的伪匿名载玻片将被发送到佛罗伦萨 Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi 的病理组织学和分子诊断研究所进行免疫组织化学分析，该分析将如下文所述进行。 一旦执行了以下分析，幻灯片将被销毁。

将从 FFPE 样品中提取的 3 μm 厚度的切片准备用于免疫组织化学分析。 样品处理将使用自动免疫染色仪（Ventana Discovery ULTRA，Ventana Medical Systems，Tucson，AZ）进行。 切片将在 EZ prep（#950-102；Ventana Medical Systems，Tucson，AZ）中脱石蜡，然后用 Cell Conditioning 1 (CC1) 缓冲液（#950-124；Ventana Medical Systems，Tucson，AZ）处理，以便促进抗原恢复。 最后，将根据所需的染色分配一抗，并使用 Ultramap 抗小鼠或抗兔检测试剂盒生成信号。 对于 TME 表征，样品将用以下主要抗体染色：CD3、CD4、CD8、CD68、CD163。 将使用 Aperio AT2 平台（Leica Biosystems，Wetzlar，DE）在全幻灯片图像 (WSI) 中对使用 IHC 处理的所有切片进行数字扫描。将在佛罗伦萨大学进行的数字病理学是一门新兴学科，它允许使用高度标准化的方法对数字图像进行定量分析。 它将允许定量测量免疫细胞之间的相互作用并表征它们的相对空间分布。 此外，它将能够生成更多信息，以便深入研究 MU 的 TME。

佛罗伦萨大学的 HALO 图像分析平台将允许：i) 细胞量化、标记强度评估、细胞区室（细胞核、细胞质、细胞膜）识别； ii) 通过识别肿瘤内和肿瘤周围部分细胞的相对分布进行空间分析； iii) 共享与数字图像一起生成的数据库。

将使用此自动数字量化系统评估标有单个或多个 IHC 的样本，以表征构成 TME 的各种细胞亚群。 通过将多重免疫组织化学与数字分析相结合，数据将得到准确分析，从而产生用于寻找新特征的新分析工作流程。 来自数字分析的所有数据都将与病理进展相关联，目的是确定 MU 病理学中的新预后因素。

在 Fondazione Policlinico Gemelli 遗传学研究所对新鲜组织样本进行研究的整个患者队列中进行了用于鉴定细胞遗传学改变的分析，因为它们在临床实践中经常进行，我们已经可以获得这些数据根据临床实践在手术室进行。 使用来自 Agilent Technologies 的寡核苷酸平台上的 Array-CGH 方法。 根据临床实践，使用 Gentra Pure Gene 商业试剂盒（QIAGEN）从 MU 样本中提取肿瘤 DNA；提取后，对获得的 DNA 的数量和纯度进行评估。 所有被认为符合质量要求的样品均按照安捷伦科技公司指定的方案进行处理。 使用细胞基因组学软件分析获得的数据。 这些分析将允许获得肿瘤的基因型特征。