Морфологическая, генетическая и опухолевая характеристика микроокружения при увеальной меланоме (MicroGenUM)

Ткани из хирургических препаратов независимо от стадии заболевания, фиксированные в формалине и включенные в парафин из образцов, уже собранных для клинической практики и хранящихся в архиве УПЦ патологической анатомии Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS, будут использованы для исследование, при условии информированного согласия пациента на использование этих образцов в исследовательских целях. УПЦ «Патологическая анатомия» позаботится о восстановлении архивных материалов (слайдов).

Псевдоанонимизированные слайды, которые будут подготовлены клинической практикой, будут отправлены в Институт патологической гистологии и молекулярной диагностики Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Флоренция, для иммуногистохимического анализа, который будет проведен, как указано ниже. После выполнения следующего анализа слайды будут уничтожены.

Срезы толщиной 3 мкм, полученные из образцов FFPE, будут подготовлены для иммуногистохимического анализа. Обработка образцов будет проводиться с использованием автоматизированного иммунного красителя (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Срезы будут депарафинизированы в препарате EZ (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) с последующей обработкой буфером Cell Conditioning 1 (CC1) (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) для того, чтобы способствуют восстановлению антигена. Наконец, первичные антитела будут распределены в соответствии с желаемым окрашиванием, а сигнал будет проявлен с помощью наборов для обнаружения Ultramap против мышей или против кроликов. Для характеристики TME образцы будут окрашены следующими первичными антителами: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Все срезы, обработанные с помощью IHC, будут сканироваться в цифровом виде в виде изображений цельных слайдов (WSI) с использованием платформы Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). Цифровая патология, которая будет проводиться во Флорентийском университете, является новой дисциплиной, которая позволяет количественный анализ цифровых изображений с использованием строго стандартизированных подходов. Это позволит количественно измерить взаимодействия между иммунными клетками и охарактеризовать их относительное пространственное распределение. Кроме того, он сможет генерировать дополнительную информацию, которая позволит глубже изучить TME MU.

Платформа анализа изображений HALO, представленная во Флорентийском университете, позволит: i) количественно определять клетки, оценивать интенсивность маркировки, распознавать клеточные компартменты (ядро, цитоплазма, мембрана); ii) пространственный анализ посредством идентификации относительного распределения клеток во внутри- и околоопухолевой части; iii) совместное использование базы данных, созданной вместе с цифровыми изображениями.

Образцы, помеченные одним или несколькими IHC, будут оцениваться с использованием этой автоматизированной цифровой системы количественной оценки, чтобы охарактеризовать различные подмножества клеток, которые составляют TME. Комбинируя множественную иммуногистохимию с цифровым анализом, данные будут точно проанализированы, что создаст новый рабочий процесс анализа для поиска новых сигнатур. Все данные, полученные в результате цифрового анализа, будут соотнесены с прогрессированием патологии с целью выявления новых прогностических факторов патологии ДЕ.

Анализ на выявление цитогенетических изменений, данные о которых уже доступны нам, поскольку они регулярно проводятся в клинической практике, был проведен на всей когорте пациентов, включенных в исследование в Институте генетики Fondazione Policlinico Gemelli на свежих образцах тканей. взятых в операционной в соответствии с клинической практикой. Были использованы методы Array-CGH на олигонуклеотидных платформах от Agilent Technologies. ДНК опухоли из образцов MU экстрагировали с использованием коммерческого набора Gentra Pure Gene (QIAGEN) в соответствии с клинической практикой; после экстракции оценивали количество и чистоту полученной ДНК. Все образцы, признанные подходящими по качеству, были обработаны в соответствии с протоколом, указанным Agilent Technologies. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения Cytogenomics. Эти анализы позволят получить генотипическую характеристику опухоли.