Caractérisation du microenvironnement morphologique, génétique et tumoral dans le mélanome uvéal (MicroGenUM)

Des tissus provenant d'échantillons chirurgicaux quel que soit le stade de la maladie, fixés dans du formol et inclus dans de la paraffine provenant d'échantillons déjà collectés pour la pratique clinique et conservés dans les archives de l'UOC d'anatomie pathologique de la Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS seront utilisés pour l'étude, sous réserve du consentement éclairé du patient à l'utilisation de ces échantillons à des fins de recherche. L'UOC Anatomia Patologica se chargera de la récupération du matériel d'archives (diapos).

Les lames pseudo-anonymisées, qui seront préparées par la pratique clinique, seront envoyées à l'Institut d'histologie pathologique et de diagnostic moléculaire de l'Azienda Ospedaliero- Universitaria Careggi, Florence pour analyse immunohistochimique, qui sera effectuée comme indiqué ci-dessous. Une fois l'analyse suivante effectuée, les lames seront détruites.

Des sections de 3 μm d'épaisseur dérivées d'échantillons FFPE seront préparées pour l'analyse immunohistochimique. Le traitement des échantillons sera effectué à l'aide d'un immunocolorant automatisé (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Les sections seront déparaffinées dans EZ prep (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), suivies d'un traitement avec le tampon Cell Conditioning 1 (CC1) (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) afin de favoriser la récupération antigénique. Enfin, des anticorps primaires seront distribués selon la coloration souhaitée et le signal sera développé avec des kits de détection anti-souris ou anti-lapin Ultramap. Pour la caractérisation TME, les échantillons seront colorés avec les anticorps primaires suivants : CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Toutes les sections traitées avec IHC seront numérisées numériquement dans Whole Slide Images (WSI) à l'aide de la plate-forme Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). La pathologie numérique, qui sera réalisée à l'Université de Florence, est une discipline émergente qui permet la analyse quantitative d'images numériques à l'aide d'approches hautement standardisées. Il permettra de mesurer quantitativement les interactions entre cellules immunitaires et de caractériser leur distribution spatiale relative. De plus, il pourra générer des informations supplémentaires qui permettront d'étudier en profondeur le TME de l'UM.

La plateforme d'analyse d'images HALO, présente à l'Université de Florence, permettra : i) la quantification cellulaire, l'évaluation de l'intensité du marquage, la reconnaissance des compartiments cellulaires (noyau, cytoplasme, membrane) ; ii) l'analyse spatiale par l'identification des distributions relatives des cellules dans la portion intra- et péri-tumorale ; iii) partage de la base de données générée avec les images numériques.

Les échantillons marqués avec un ou plusieurs IHC seront évalués à l'aide de ce système de quantification numérique automatisé afin de caractériser les différents sous-ensembles de cellules qui composent le TME. En combinant l'immunohistochimie multiple avec l'analyse numérique, les données seront analysées avec précision, produisant ainsi un nouveau flux de travail d'analyse pour trouver de nouvelles signatures. Toutes les données issues de l'analyse numérique seront corrélées avec l'évolution de la pathologie, dans le but d'identifier de nouveaux facteurs pronostiques dans la pathologie de l'UM.

L'analyse pour l'identification des altérations cytogénétiques, dont les données nous sont déjà disponibles car elles sont régulièrement réalisées en pratique clinique, a été réalisée sur l'ensemble de la cohorte de patients inscrits pour l'étude à l'Institut de Génétique de la Fondazione Policlinico Gemelli sur des échantillons de tissus frais prises au bloc opératoire selon la pratique clinique. Des méthodes Array-CGH sur des plateformes d'oligonucléotides d'Agilent Technologies ont été utilisées. L'ADN tumoral des échantillons de MU a été extrait à l'aide du kit commercial Gentra Pure Gene (QIAGEN) conformément à la pratique clinique ; une fois extrait, la quantité et la pureté de l'ADN obtenu ont été évaluées. Tous les échantillons jugés appropriés pour la qualité ont été traités selon le protocole indiqué par Agilent Technologies. Les données obtenues ont été analysées à l'aide du logiciel Cytogenomics. Ces analyses permettront d'obtenir une caractérisation génotypique de la tumeur.