Caracterização Morfológica, Genética e do Microambiente Tumoral no Melanoma Uveal (MicroGenUM)

Tecidos de espécimes cirúrgicos independentemente do estágio da doença, fixados em formalina e incluídos em parafina de amostras já coletadas para a prática clínica e mantidas nos arquivos da UOC de Anatomia Patológica da Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS serão utilizados para o estudo, sujeito ao consentimento informado do paciente para o uso dessas amostras para fins de pesquisa. A UOC Anatomia Patológica cuidará da recuperação do material de arquivo (slides).

As lâminas pseudoanônimas, que serão preparadas pela prática clínica, serão enviadas ao Instituto de Histologia Patológica e Diagnóstico Molecular da Azienda Ospedaliero- Universitaria Careggi, Florença para análise imuno-histoquímica, que será realizada conforme relatado abaixo. Uma vez realizada a seguinte análise, as lâminas serão destruídas.

Secções de 3 μm de espessura derivadas de amostras de FFPE serão preparadas para análise imuno-histoquímica. O processamento da amostra será realizado usando um imunomarcador automatizado (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Os cortes serão desparafinados em preparação EZ (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), seguido de tratamento com tampão Cell Conditioning 1 (CC1) (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) para promover a recuperação antigênica. Por fim, os anticorpos primários serão dispensados ​​de acordo com a coloração desejada e o sinal será desenvolvido com kits de detecção Ultramap anti-rato ou anti-coelho. Para a caracterização de TME, as amostras serão coradas com os seguintes anticorpos primários: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Todas as seções processadas com IHC serão escaneadas digitalmente em Whole Slide Images (WSI) usando a plataforma Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). A Patologia Digital, que será realizada na Universidade de Florença, é uma disciplina emergente que permite o análise quantitativa de imagens digitais usando abordagens altamente padronizadas. Ele permitirá medições quantitativas das interações entre células imunes e caracterizará sua distribuição espacial relativa. Além disso, poderá gerar mais informações que permitirão um estudo mais aprofundado do TME da UM.

A plataforma de análise de imagens HALO, presente na Universidade de Florença, permitirá: i) quantificação celular, avaliação da intensidade da marcação, reconhecimento de compartimentos celulares (núcleo, citoplasma, membrana); ii) análise espacial através da identificação das distribuições relativas de células na porção intra e peritumoral; iii) compartilhamento do banco de dados gerado juntamente com as imagens digitais.

Amostras marcadas com IHC simples ou múltiplas serão avaliadas usando este sistema automatizado de quantificação digital, a fim de caracterizar os vários subconjuntos de células que compõem o TME. Ao combinar imuno-histoquímica múltipla com análise digital, os dados serão analisados ​​com precisão, produzindo assim um novo fluxo de trabalho de análise para encontrar novas assinaturas. Todos os dados derivados da análise digital serão correlacionados com a evolução da patologia, com o objetivo de identificar novos fatores prognósticos na patologia da UM.

A análise para a identificação de alterações citogenéticas, cujos dados já estão disponíveis para nós por serem realizadas regularmente na prática clínica, foi realizada em toda a coorte de pacientes inscritos para o estudo no Instituto de Genética da Fondazione Policlinico Gemelli em amostras de tecido fresco tomadas no bloco operatório de acordo com a prática clínica. Métodos Array-CGH em plataformas de oligonucleotídeos da Agilent Technologies foram usados. O DNA tumoral das amostras de MU foi extraído usando o kit comercial Gentra Pure Gene (QIAGEN) de acordo com a prática clínica; uma vez extraído, avaliou-se a quantidade e a pureza do DNA obtido. Todas as amostras consideradas adequadas para qualidade foram processadas seguindo o protocolo indicado pela Agilent Technologies. Os dados obtidos foram analisados ​​usando o software Cytogenomics. Estas análises permitirão obter uma caracterização genotípica do tumor.