Morfologinen, geneettinen ja tuumorimikroympäristön karakterisointi uveal-melanoomassa (MicroGenUM)

Kudoksia kirurgisista näytteistä sairauden vaiheesta riippumatta, jotka on kiinnitetty formaliiniin ja sisällytetty parafiiniin näytteistä, jotka on jo kerätty kliinistä toimintaa varten ja joita säilytetään Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS:n patologisen anatomian UOC:n arkistossa, käytetään tutkimukseen edellyttäen, että potilas suostuu näiden näytteiden käyttöön tutkimustarkoituksiin. UOC Anatomia Patologica huolehtii arkistomateriaalin (diojen) palauttamisesta.

Pseudoanonymisoidut objektilasit, jotka valmistetaan kliinisen käytännön avulla, lähetetään Azienda Ospedaliero- Universitaria Careggin Patologisen histologian ja molekyylidiagnostiikan instituuttiin, Firenzeen immunohistokemiallista analyysiä varten, joka suoritetaan alla kuvatulla tavalla. Kun seuraava analyysi on suoritettu, objektilasit tuhotaan.

Immunohistokemiallista analyysiä varten valmistetaan FFPE-näytteistä johdettuja 3 μm paksuisia leikkeitä. Näytteen käsittely suoritetaan käyttämällä automaattista immunovärjäystä (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Leikkeistä poistetaan parafiini EZ-valmistelussa (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), jonka jälkeen käsitellään Cell Conditioning 1 (CC1) -puskurilla (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) edistää antigeenien palautumista. Lopuksi primääriset vasta-aineet annostellaan halutun värjäyksen mukaan ja signaali kehitetään Ultramap anti-hiiri- tai anti-kanin havaitsemissarjoilla. TME:n karakterisointia varten näytteet värjätään seuraavilla primäärisillä vasta-aineilla: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Kaikki IHC:llä käsitellyt osat skannataan digitaalisesti kokonaisina diakuvina (WSI) käyttäen Aperio AT2 -alustaa (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). Firenzen yliopistossa suoritettava digitaalinen patologia on nouseva tieteenala, joka mahdollistaa digitaalisten kuvien kvantitatiivinen analyysi käyttämällä erittäin standardoituja lähestymistapoja. Se mahdollistaa immuunisolujen välisten vuorovaikutusten kvantitatiivisen mittauksen ja luonnehtia niiden suhteellista alueellista jakautumista. Lisäksi se pystyy tuottamaan lisätietoa, joka mahdollistaa MU:n TME:n syvällisen tutkimisen.

Firenzen yliopistossa oleva HALO-kuvaanalyysialusta mahdollistaa: i) solujen kvantifioinnin, merkinnän intensiteetin arvioinnin, soluosastojen (ydin, sytoplasma, kalvo) tunnistamisen; ii) spatiaalinen analyysi tunnistamalla solujen suhteelliset jakaumat kasvaimen sisäisessä ja perimäisessä osassa; iii) digitaalisten kuvien kanssa luodun tietokannan jakaminen.

Näytteet, jotka on merkitty yhdellä tai usealla IHC:llä, arvioidaan käyttämällä tätä automaattista digitaalista kvantifiointijärjestelmää TME:n muodostavien solujen eri osajoukkojen karakterisoimiseksi. Yhdistämällä useita immunohistokemiaa digitaaliseen analyysiin, tiedot analysoidaan tarkasti, mikä tuottaa uuden analyysityönkulun uusien allekirjoitusten etsimiseen. Kaikki digitaalisesta analyysistä saatu data korreloidaan patologian etenemisen kanssa tavoitteena tunnistaa uusia prognostisia tekijöitä MU:n patologiassa.

Analyysi sytogeneettisten muutosten tunnistamiseksi, joiden tiedot ovat jo saatavilla, koska niitä tehdään säännöllisesti kliinisessä käytännössä, tehtiin Fondazione Policlinico Gemellin genetiikkainstituutin koko tutkimukseen ilmoittautuneelle potilasryhmälle tuoreilla kudosnäytteillä. otettu leikkaussalissa kliinisen käytännön mukaisesti. Array-CGH-menetelmiä käytettiin Agilent Technologiesin oligonukleotidialustalla. Kasvain-DNA MU-näytteistä uutettiin käyttämällä kaupallista Gentra Pure Gene -pakkausta (QIAGEN) kliinisen käytännön mukaisesti; kun se oli uutettu, saadun DNA:n määrä ja puhtaus arvioitiin. Kaikki laatuun sopiviksi katsotut näytteet käsiteltiin Agilent Technologiesin ilmoittaman protokollan mukaisesti. Saadut tiedot analysoitiin käyttämällä Cytogenomics-ohjelmistoa. Nämä analyysit mahdollistavat kasvaimen genotyyppisen karakterisoinnin saamisen.