Morfologická, genetická a nádorová charakterizace mikroprostředí u uveálního melanomu (MicroGenUM)

Tkáně z chirurgických vzorků bez ohledu na stadium onemocnění, fixované ve formalínu a obsažené v parafínu ze vzorků již odebraných pro klinickou praxi a uchovávaných v archivu UOC patologické anatomie Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS budou použity pro studie, za předpokladu informovaného souhlasu pacienta s použitím těchto vzorků pro výzkumné účely. O obnovu archivního materiálu (diapozitivů) se postará UOC Anatomia Patologica.

Pseudoanonymizované preparáty, které budou připraveny klinickou praxí, budou zaslány do Ústavu patologické histologie a molekulární diagnostiky Azienda Ospedaliero- Universitaria Careggi, Florencie k imunohistochemické analýze, která bude provedena, jak je uvedeno níže. Po provedení následující analýzy budou sklíčka zničena.

Řezy o tloušťce 3 μm získané ze vzorků FFPE budou připraveny pro imunohistochemickou analýzu. Zpracování vzorků bude provedeno pomocí automatizovaného imunostaineru (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Řezy budou zbaveny parafinu v EZ prep (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), následuje ošetření pufrem Cell Conditioning 1 (CC1) (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), aby podporovat obnovu antigenu. Nakonec budou primární protilátky rozděleny podle požadovaného barvení a signál bude vyvinut pomocí detekčních souprav Ultramap proti myším nebo králíkům. Pro charakterizaci TME budou vzorky obarveny následujícími primárními protilátkami: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Všechny řezy zpracované pomocí IHC budou digitálně naskenovány v Whole Slide Images (WSI) pomocí platformy Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). Digitální patologie, která bude prováděna na University of Florence, je nově vznikající disciplína, která umožňuje kvantitativní analýza digitálních obrazů pomocí vysoce standardizovaných přístupů. Umožní kvantitativní měření interakcí mezi imunitními buňkami a charakterizuje jejich relativní prostorovou distribuci. Navíc bude schopen generovat další informace, které umožní hloubkové studium TME MU.

Platforma pro analýzu obrazu HALO, přítomná na Univerzitě ve Florencii, umožní: i) kvantifikaci buněk, vyhodnocení intenzity značení, rozpoznání buněčných kompartmentů (jádro, cytoplazma, membrána); ii) prostorová analýza prostřednictvím identifikace relativních distribucí buněk v intra- a peri-tumorové části; iii) sdílení databáze vytvořené společně s digitálními obrázky.

Vzorky označené jedním nebo více IHC budou vyhodnoceny pomocí tohoto automatizovaného digitálního kvantifikačního systému, aby bylo možné charakterizovat různé podskupiny buněk, které tvoří TME. Kombinací více imunohistochemických analýz s digitální analýzou budou data přesně analyzována, čímž vznikne nový analytický pracovní postup pro nalezení nových signatur. Všechna data odvozená z digitální analýzy budou korelována s progresí patologie s cílem identifikovat nové prognostické faktory v patologii MU.

Analýza pro identifikaci cytogenetických změn, jejichž data máme již k dispozici, protože jsou pravidelně prováděny v klinické praxi, byla provedena na celém souboru pacientů zařazených do studie v Genetickém ústavu Fondazione Policlinico Gemelli na čerstvých vzorcích tkání. odebrané na operačním sále podle klinické praxe. Byly použity metody Array-CGH na oligonukleotidových platformách od Agilent Technologies. Nádorová DNA ze vzorků MU byla extrahována pomocí komerční sady Gentra Pure Gene (QIAGEN) podle klinické praxe; po extrakci bylo hodnoceno množství a čistota získané DNA. Všechny vzorky považované za vhodné pro kvalitu byly zpracovány podle protokolu uvedeného společností Agilent Technologies. Získaná data byla analyzována pomocí softwaru Cytogenomics. Tyto analýzy umožní získat genotypovou charakterizaci nádoru.