Morfologisk, genetisk og tumormikromiljøkarakterisering i uveal melanom (MicroGenUM)

Vev fra kirurgiske prøver uavhengig av sykdomsstadiet, fiksert i formalin og inkludert i parafin fra prøver som allerede er samlet inn for klinisk praksis og oppbevart i arkivene til UOC of Pathological Anatomy ved Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS vil bli brukt til studien, med forbehold om pasientens informerte samtykke til bruk av disse prøvene til forskningsformål. UOC Anatomia Patologica vil ta seg av gjenvinning av arkivmateriale (lysbilder).

De pseudoanonymiserte lysbildene, som vil bli utarbeidet av klinisk praksis, vil bli sendt til Institute of Pathological Histology and Molecular Diagnostics ved Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Firenze for immunhistokjemisk analyse, som vil bli utført som rapportert nedenfor. Når følgende analyse er utført, vil lysbildene bli ødelagt.

Seksjoner med 3 μm tykkelse avledet fra FFPE-prøver vil bli klargjort for immunhistokjemisk analyse. Prøvebehandling vil bli utført ved hjelp av en automatisert immunfarger (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Seksjoner vil bli avparafinisert i EZ prep (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), etterfulgt av behandling med Cell Conditioning 1 (CC1) buffer (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) for å fremme antigen utvinning. Til slutt vil primære antistoffer dispenseres i henhold til ønsket farging og signalet vil bli utviklet med Ultramap anti-mus eller anti-kanin deteksjonssett. For TME-karakterisering vil prøvene farges med følgende primære antistoffer: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Alle seksjoner som behandles med IHC vil bli skannet digitalt i Whole Slide Images (WSI) ved hjelp av Aperio AT2-plattformen (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). Digital patologi, som vil bli utført ved Universitetet i Firenze, er en ny disiplin som gjør kvantitativ analyse av digitale bilder ved bruk av høyt standardiserte tilnærminger. Det vil tillate kvantitative målinger av interaksjonene mellom immunceller og karakterisere deres relative romlige fordeling. I tillegg vil den kunne generere ytterligere informasjon som gjør at TME til MU kan studeres i dybden.

HALO-bildeanalyseplattformen, tilstede ved Universitetet i Firenze, vil tillate: i) cellekvantifisering, evaluering av intensiteten til markeringen, gjenkjenning av cellerom (kjerne, cytoplasma, membran); ii) romlig analyse gjennom identifisering av de relative distribusjonene av celler i intra- og peritumordelen; iii) deling av databasen generert sammen med de digitale bildene.

Prøver merket med enkelt eller flere IHC vil bli evaluert ved hjelp av dette automatiserte digitale kvantifiseringssystemet for å karakterisere de ulike celleundergruppene som utgjør TME. Ved å kombinere multippel immunhistokjemi med digital analyse, vil dataene bli nøyaktig analysert, og dermed produsere en ny analysearbeidsflyt for å finne nye signaturer. Alle data utledet fra den digitale analysen vil være korrelert med progresjonen av patologien, med sikte på å identifisere nye prognostiske faktorer i patologien til MU.

Analysen for identifisering av cytogenetiske endringer, hvis data allerede er tilgjengelige for oss siden de regelmessig utføres i klinisk praksis, ble utført på hele kohorten av pasienter som ble registrert for studien ved Genetics Institute of Fondazione Policlinico Gemelli på ferske vevsprøver tatt på operasjonssalen i henhold til klinisk praksis. Array-CGH-metoder på oligonukleotidplattformer fra Agilent Technologies ble brukt. Tumor-DNA fra MU-prøver ble ekstrahert ved bruk av Gentra Pure Gene kommersielle kit (QIAGEN) i henhold til klinisk praksis; etter ekstrahering ble mengden og renheten av det oppnådde DNA evaluert. Alle prøver som ble ansett som egnet for kvalitet ble behandlet etter protokollen angitt av Agilent Technologies. Dataene som ble oppnådd ble analysert ved bruk av Cytogenomics-programvare. Disse analysene vil gjøre det mulig å oppnå en genotypisk karakterisering av svulsten.