Morfológiai, genetikai és tumor mikrokörnyezet jellemzése uvealis melanomában (MicroGenUM)

A sebészeti mintákból származó szöveteket, a betegség stádiumától függetlenül, formalinban rögzítve, és a klinikai gyakorlatban már gyűjtött, a Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS patológiai anatómiai osztályának archívumában őrzött mintákból származó paraffinban felhasználják a vizsgálat, feltéve, hogy a páciens beleegyezését adja e minták kutatási célú felhasználásához. Az archív anyagok (diák) visszanyeréséről az UOC Anatomia Patologica gondoskodik.

A klinikai gyakorlat által elkészített, pszeudoanonimizált tárgylemezeket a firenzei Azienda Ospedaliero- Universitaria Careggi Patológiai Szövettani és Molekuláris Diagnosztikai Intézetébe küldik immunhisztokémiai elemzés céljából, amelyet az alábbiakban leírtak szerint végeznek el. A következő elemzés elvégzése után a tárgylemezek megsemmisülnek.

Az FFPE mintákból származó 3 μm vastag metszeteket készítünk immunhisztokémiai elemzéshez. A mintafeldolgozás automatizált immunfestő berendezéssel történik (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). A metszeteket paraffinmentesítjük az EZ prep-ben (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), majd Cell Conditioning 1 (CC1) pufferrel (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) kezeljük. elősegíti az antigén helyreállítását. Végül a primer antitesteket a kívánt festésnek megfelelően adagolják, és a jelet Ultramap egér vagy nyúl elleni detektáló készletekkel fejlesztik. A TME jellemzéséhez a mintákat a következő elsődleges antitestekkel festik meg: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Minden IHC-vel feldolgozott metszet digitálisan szkennelve lesz teljes diaképben (WSI) az Aperio AT2 platformon (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). A Firenzei Egyetemen végzett digitális patológia egy olyan feltörekvő tudományág, amely lehetővé teszi a digitális képek kvantitatív elemzése erősen szabványosított megközelítések alkalmazásával. Lehetővé teszi az immunsejtek közötti kölcsönhatások kvantitatív mérését, és jellemzi relatív térbeli eloszlásukat. Ezenkívül képes lesz további információkat generálni, amelyek lehetővé teszik az MU TME-jének mélyreható tanulmányozását.

A Firenzei Egyetemen jelenlévő HALO képelemző platform lehetővé teszi: i) a sejtek mennyiségi meghatározását, a jelölés intenzitásának értékelését, a sejtkompartmentek (mag, citoplazma, membrán) felismerését; ii) térbeli elemzés a sejtek relatív eloszlásának azonosítása révén a tumoron belüli és peri-tumor részben; iii) a digitális képekkel együtt generált adatbázis megosztása.

Az egyszeres vagy többszörös IHC-vel jelölt mintákat ezzel az automatizált digitális kvantifikációs rendszerrel értékelik ki, hogy jellemezzék a TME-t alkotó különböző sejtalcsoportokat. A többszörös immunhisztokémia és a digitális elemzés kombinálásával az adatok pontosan elemezhetők, így új elemzési munkafolyamat jön létre az új aláírások megtalálásához. A digitális elemzésből származó összes adatot korrelálni kell a patológia progressziójával, azzal a céllal, hogy új prognosztikai tényezőket azonosítsanak a MU patológiájában.

A citogenetikai elváltozások azonosítását célzó elemzést, amelynek adatai már rendelkezésünkre állnak, mivel ezeket rendszeresen elvégzik a klinikai gyakorlatban, a Fondazione Policlinico Gemelli Genetikai Intézetében a vizsgálatra beiratkozott betegek teljes csoportján végezték el friss szövetmintákon. a műtőben a klinikai gyakorlatnak megfelelően. Array-CGH módszereket alkalmaztunk az Agilent Technologies oligonukleotid platformjain. A MU-mintákból származó tumor DNS-t a Gentra Pure Gene kereskedelmi kit (QIAGEN) segítségével extraháltuk a klinikai gyakorlatnak megfelelően; az extrahálást követően a kapott DNS mennyiségét és tisztaságát értékelték. A minőségre alkalmasnak ítélt összes mintát az Agilent Technologies által jelzett protokoll szerint dolgoztuk fel. A kapott adatokat Cytogenomics szoftverrel elemeztük. Ezek az elemzések lehetővé teszik a tumor genotípusos jellemzését.