Morfologisk, genetisk og tumormikromiljøkarakterisering i uveal melanom (MicroGenUM)

Væv fra kirurgiske prøver uanset sygdomsstadiet, fikseret i formalin og inkluderet i paraffin fra prøver, der allerede er indsamlet til klinisk praksis og opbevaret i arkiverne hos UOC of Pathological Anatomy ved Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS, vil blive brugt til undersøgelsen med forbehold af patientens informerede samtykke til brugen af ​​disse prøver til forskningsformål. UOC Anatomia Patologica vil tage sig af inddrivelsen af ​​arkivmateriale (slides).

De pseudoanonymiserede objektglas, som vil blive udarbejdet af klinisk praksis, vil blive sendt til Institut for Patologisk Histologi og Molekylær Diagnostik i Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Firenze til immunhistokemisk analyse, som vil blive udført som rapporteret nedenfor. Når den følgende analyse er blevet udført, vil objektglassene blive ødelagt.

Sektioner med en tykkelse på 3 μm afledt af FFPE-prøver vil blive forberedt til immunhistokemisk analyse. Prøvebehandling vil blive udført ved hjælp af en automatiseret immunfarver (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Sektioner vil blive afparaffineret i EZ prep (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), efterfulgt af behandling med Cell Conditioning 1 (CC1) buffer (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) for at fremme antigengendannelse. Til sidst vil primære antistoffer blive dispenseret i henhold til den ønskede farvning, og signalet vil blive udviklet med Ultramap anti-mus eller anti-kanin detektionskit. Til TME-karakterisering vil prøver blive farvet med følgende primære antistoffer: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Alle sektioner, der behandles med IHC, vil blive scannet digitalt i Whole Slide Images (WSI) ved hjælp af Aperio AT2-platformen (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). kvantitativ analyse af digitale billeder ved hjælp af højt standardiserede tilgange. Det vil tillade kvantitative målinger af interaktionerne mellem immunceller og karakterisere deres relative rumlige fordeling. Derudover vil det være i stand til at generere yderligere information, der vil gøre det muligt at studere MU's TME i dybden.

HALO-billedanalyseplatformen, som er til stede ved universitetet i Firenze, vil tillade: i) cellekvantificering, evaluering af intensiteten af ​​mærkningen, genkendelse af celle-rum (kerne, cytoplasma, membran); ii) rumlig analyse gennem identifikation af de relative fordelinger af celler i intra- og peritumordelen; iii) deling af databasen genereret sammen med de digitale billeder.

Prøver mærket med enkelt eller flere IHC vil blive evalueret ved hjælp af dette automatiserede digitale kvantificeringssystem for at karakterisere de forskellige celleundersæt, der udgør TME. Ved at kombinere multipel immunhistokemi med digital analyse, vil dataene blive analyseret nøjagtigt, og dermed producere en ny analyse work-flow til at finde nye signaturer. Alle data afledt af den digitale analyse vil blive korreleret med udviklingen af ​​patologien, med det formål at identificere nye prognostiske faktorer i patologien af ​​MU.

Analysen til identifikation af cytogenetiske ændringer, hvis data allerede er tilgængelige for os, da de regelmæssigt udføres i klinisk praksis, blev udført på hele kohorten af ​​patienter, der er tilmeldt undersøgelsen på Genetics Institute of Fondazione Policlinico Gemelli på friske vævsprøver taget på operationsstuen i henhold til klinisk praksis. Array-CGH-metoder på oligonukleotidplatforme fra Agilent Technologies blev anvendt. Tumor-DNA fra MU-prøver blev ekstraheret under anvendelse af Gentra Pure Gene-kommercielle kit (QIAGEN) i henhold til klinisk praksis; når det var ekstraheret, blev mængden og renheden af ​​det opnåede DNA vurderet. Alle prøver, der blev anset for egnede til kvalitet, blev behandlet efter protokollen angivet af Agilent Technologies. De opnåede data blev analyseret ved anvendelse af Cytogenomics-software. Disse analyser gør det muligt at opnå en genotypisk karakterisering af tumoren.