Morfologische, genetische en tumor-micro-omgevingskarakterisering in oogmelanoom (MicroGenUM)

Weefsels van chirurgische monsters, ongeacht het stadium van de ziekte, gefixeerd in formaline en opgenomen in paraffine van monsters die al zijn verzameld voor klinische praktijk en worden bewaard in de archieven van de UOC of Pathological Anatomy van de Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS zal worden gebruikt voor het onderzoek, onder voorbehoud van geïnformeerde toestemming van de patiënt voor het gebruik van deze monsters voor onderzoeksdoeleinden. Het UOC Anatomia Patologica zal zorgdragen voor de recuperatie van archiefmateriaal (dia's).

De gepseudo-anonimiseerde objectglaasjes, die door de klinische praktijk zullen worden voorbereid, zullen naar het Instituut voor Pathologische Histologie en Moleculaire Diagnostiek van de Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Florence worden gestuurd voor immunohistochemische analyse, die zal worden uitgevoerd zoals hieronder vermeld. Nadat de volgende analyse is uitgevoerd, worden de objectglaasjes vernietigd.

Secties met een dikte van 3 μm afgeleid van FFPE-monsters zullen worden voorbereid voor immunohistochemische analyse. Monsterverwerking zal worden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde immunostainer (Ventana Discovery ULTRA, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Secties worden gedeparaffineerd in EZ prep (#950-102; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), gevolgd door behandeling met Cell Conditioning 1 (CC1) buffer (#950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) om antigeen herstel bevorderen. Ten slotte zullen primaire antilichamen worden afgegeven volgens de gewenste kleuring en het signaal zal worden ontwikkeld met Ultramap antimuis- of antikonijndetectiekits. Voor TME-karakterisering zullen monsters worden gekleurd met de volgende primaire antilichamen: CD3, CD4, CD8, CD68, CD163. Alle secties die met IHC worden verwerkt, worden digitaal gescand in Whole Slide Images (WSI) met behulp van het Aperio AT2-platform (Leica Biosystems, Wetzlar, DE). Digitale pathologie, die zal worden uitgevoerd aan de Universiteit van Florence, is een opkomende discipline waarmee de kwantitatieve analyse van digitale beelden met behulp van sterk gestandaardiseerde benaderingen. Het zal kwantitatieve metingen van de interacties tussen immuuncellen mogelijk maken en hun relatieve ruimtelijke verdeling karakteriseren. Bovendien zal het in staat zijn om verdere informatie te genereren waarmee de TME van de MU diepgaand kan worden bestudeerd.

Het HALO-beeldanalyseplatform, aanwezig aan de Universiteit van Florence, zal het volgende mogelijk maken: i) celkwantificering, evaluatie van de intensiteit van de markering, herkenning van celcompartimenten (kern, cytoplasma, membraan); ii) ruimtelijke analyse door de identificatie van de relatieve verdelingen van cellen in het intra- en peri-tumorgedeelte; iii) delen van de database die samen met de digitale beelden is gegenereerd.

Monsters gelabeld met enkele of meervoudige IHC zullen worden geëvalueerd met behulp van dit geautomatiseerde digitale kwantificatiesysteem om de verschillende celsubsets waaruit de TME bestaat te karakteriseren. Door meerdere immunohistochemie te combineren met digitale analyse, worden de gegevens nauwkeurig geanalyseerd, waardoor een nieuwe analyseworkflow ontstaat voor het vinden van nieuwe handtekeningen. Alle gegevens afkomstig van de digitale analyse zullen worden gecorreleerd met de progressie van de pathologie, met als doel nieuwe prognostische factoren in de pathologie van MU te identificeren.

De analyse voor de identificatie van cytogenetische veranderingen, waarvan de gegevens al voor ons beschikbaar zijn omdat ze regelmatig in de klinische praktijk worden uitgevoerd, werd uitgevoerd op het volledige cohort van patiënten die deelnamen aan de studie aan het Genetisch Instituut van de Fondazione Policlinico Gemelli op verse weefselmonsters genomen in de operatiekamer volgens de klinische praktijk. Array-CGH-methoden op oligonucleotideplatforms van Agilent Technologies werden gebruikt. Tumor-DNA uit MU-monsters werd geëxtraheerd met behulp van de Gentra Pure Gene commerciële kit (QIAGEN) volgens de klinische praktijk; eenmaal geëxtraheerd, werd de hoeveelheid en zuiverheid van het verkregen DNA geëvalueerd. Alle monsters die geschikt werden geacht voor kwaliteit, werden verwerkt volgens het door Agilent Technologies aangegeven protocol. De verkregen gegevens werden geanalyseerd met behulp van Cytogenomics-software. Deze analyses zullen een genotypische karakterisering van de tumor mogelijk maken.