原発性扁平上皮癌から分離された細胞培養における HLA-DR の研究

いくつかの研究は、腫瘍細胞における MHC II (主要組織適合性複合体クラス II) 分子、特に HLA-DR (ヒト白血球抗原) 分子の発現と疾患の臨床転帰との間の相関関係を実証しています。 実際、IFN-γの炎症刺激を受けた腫瘍細胞は、非専門的なAPC（抗原提示細胞）として機能するMHC II分子を発現できるようになることが観察されている。 APC 細胞は、T リンパ球に抗原を提示して T リンパ球の活性化を誘導する役割を担っています。これには必然的に 2 つのシグナルの存在が必要です。1 つ目は MHC 分子 (CD4+ リンパ球の MHC クラス II) によって誘導され、2 つ目は共刺激分子によって誘導されます。 CD80 または CD86。これがないとリンパ球はアネルギー状態になります。

腫瘍細胞におけるこれらの分子の発現の役割については依然として議論の余地があるが、HLA-DR 発現と臨床転帰との正の関連性は、喉頭の扁平上皮癌、結腸直腸癌などのさまざまな種類の腫瘍に関するいくつかの研究で報告されている。 、胃がんなど。 また、我々の研究「頭頸部扁平上皮癌における主要組織適合性複合体クラス II-HLA-DR の分子の発現」(ID 2222) において、研究者らは、扁平上皮癌の腫瘍性上皮細胞が、頭と首はHLA-DRを発現する能力を獲得します（データは示されていませんが、インパクトファクターを含むジャーナルに提出される科学的研究と博士課程の学生キアラ・プランポリーニの神経科学の最終博士論文の進行中です）。 一部の種類の腫瘍では、HLA-DR の発現は、良好な予後と関連する CD16+/CD11c マクロファージ骨髄細胞や損傷組織で呼び戻される T 細胞などの免疫細胞の存在と相関しており、免疫原性細胞の形成を決定します。したがって、抗腫瘍免疫応答をサポートできる微環境。 したがって、HLA-DR 分子の発現の変動は、腫瘍部位における免疫の関与の違いを説明し、腫瘍の進行を阻止する宿主の能力を条件づけるであろう。

腫瘍の進行における基本的な役割は微環境であり、これに焦点を当てた研究がますます増えています。 腫瘍微小環境はさまざまな細胞集団によって特徴付けられ、その中で最も豊富な集団は腫瘍関連線維芽細胞 (CAF) です。 CAF は線維芽細胞であり、腫瘍の状況では筋線維芽細胞と同様の表現型をとり、それらの特異的マーカーである α-sma、FAP、および FSP-1 の発現が高いことによって正常な線維芽細胞と区別できます。ビメンチン、フィブロネクチン、XI型コラーゲンの発現が増加します。 さまざまな種類の腫瘍における多数の証拠は、これらの細胞がインビトロで T リンパ球の増殖を阻害する能力があるため、アポトーシスを促進したり、制御性 T リンパ球の表現型を誘導したりする免疫抑制の役割の両方を報告しています。それらは腫瘍の増殖と浸潤、血管新生と転移を促進することができるため、予後の悪化に寄与する前腫瘍の役割があります。

多くの研究が、CAF によって分泌されるどの因子が CAF の機能に関与しているかについて研究を進めています。 特に、CAFによって分泌される多くの因子の中に、骨髄由来間葉細胞上のHLA-DR分子の活性化を誘導できることが実証されているインターロイキンIL-17およびIL-33があります。 したがって、CAF に代表される腫瘍微小環境の存在に関連した HLA-DR の役割を調査することは興味深いと思われます。研究の目的 研究の目的 研究の主な目的

• 頭頸部の原発性扁平上皮癌患者の病理学的および健康な組織サンプルから、腫瘍上皮および癌関連線維芽細胞（CAF）細胞の培養物を分離する 研究の二次目的
• 得られた細胞培養物における HLA-DR の発現を調査する。 登録患者と登録方法 サンプル サイズの計算 サンプル サイズの計算は検出力分析を使用して実行され、検査検出力 90% で 5% に等しい第 1 タイプの誤差は許容されるとみなされたため、第 2 タイプの誤差は 10% とみなされました。 比較対象の 2 つのグループ (グループ A: 健康な組織、グループ B: 病理学的組織) 間で検出される最小許容差であるデルタと、検査対象の集団に関する標準偏差を決定するために、効果量の計算が行われました。 Choen によって提案されたガイドライン。

患者 2020年から2021年にローマのIRCCSにあるFondazione Policlinico Gemelli耳鼻咽喉科クリニックに外科的治療のために入院した頭頸部の原発性扁平上皮癌の患者4名が研究に含まれる。

検討されている 4 つのケースのうち、次のものが利用可能です。

• 臨床データ
• インフォームドコンセント
• 腫瘍組織サンプル
• 手術中に外科的に除去された材料から採取された非腫瘍組織サンプル

インフォームド・コンセント 研究に参加する被験者は、プロジェクト情報シートを読み、保存されている生体物質および臨床データを研究目的で使用することについてのインフォームド・コンセントに個人的に署名するよう求められます。

有機材料 研究に含まれる各患者について、病理学的組織と、対照として使用される治療手術中に除去された健康な組織の両方から生検が採取されます。 両方の生検は培養されます。

5. 研究デザイン この研究は非営利の単一センターであり、2 つのフェーズで構成されます。 予想される研究期間は 12 か月です。

Iフェーズ:

細胞集団の選択

特定の培養培地を通じて次のものが選択されます。

• 健康な生検から得た上皮細胞および腫瘍生検から得た腫瘍上皮細胞は、DMEM 高グルコース + HAM'S F12 1:1、FBS 10%、ペニシリン-ストレプトマイシン 1%、L-グルタミン 1%、インスリン 10µg /ml、EGF 20ng で培養維持されました。 /ml、ヒドロコルチゾン 0.5μg/ml;
• 健康な生検からの線維芽細胞および腫瘍生検からの腫瘍関連線維芽細胞 (CAF) は、DMEM 高グルコース、FBS 10%、ペニシリン-ストレプトマイシン 1%、L-グルタミン 1% を含む培養液で維持されました。 線維芽細胞とCAFは両方とも、トリプシン-EDTA 0.25%中で一連の継代培養を行うことで、それぞれ上皮細胞培養物と腫瘍細胞培養物から単離されます。

健康な生検からの細胞集団 (健康な上皮細胞および線維芽細胞) をネガティブコントロールとして使用します。

フェーズ II: 腫瘍上皮細胞および腫瘍 CAF における HLA-DR 発現の評価 HLA-DR 陽性性は、古典的な共刺激分子の存在の評価に加えて、上皮マーカー (サイトケラチン) を追加した二重免疫蛍光分析によって評価されます。 (CD80、CD86)。

共刺激分子を発現しない HLA-DR+ 腫瘍細胞は、それらの発現を誘導するために、IFN-α および LPS の投与により培養内で刺激されます。

統計分析 カテゴリデータ (健康な組織と病的な組織) 間の比較は、必要に応じてカイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定によって行われます。 すべての検定は両側検定であり、アルファ <0.05 は統計的に有意であるとみなされます。