Studio di HLA-DR in colture cellulari isolate da carcinoma a cellule squamose primarie

Numerosi studi hanno dimostrato una correlazione tra l'espressione sulle cellule tumorali di molecole MHC II (complesso maggiore di istocompatibilità di classe II), in particolare di molecole HLA-DR (antigene luecocitario umano), e l'esito clinico della malattia. Infatti, è stato osservato che le cellule tumorali sotto stimolazione infiammatoria dell'IFN-γ diventano capaci di esprimere molecole MHC II funzionando come APC (cellule presentanti l'antigene) non professionali. Le cellule APC hanno il compito di presentare l'antigene ai linfociti T, inducendone così l'attivazione, che richiede necessariamente la presenza di due segnali: il primo indotto dalle molecole MHC (MHC di classe II per i linfociti CD4+) e il secondo indotto dalle molecole costimolatrici. CD80 o CD86, senza il quale i linfociti subiscono uno stato di anergia.

Sebbene il ruolo dell’espressione di queste molecole sulle cellule neoplastiche rimanga ancora altamente controverso, un’associazione positiva tra espressione di HLA-DR ed esito clinico è stata riportata da diversi studi su vari tipi di tumori: nel carcinoma a cellule squamose della laringe, nel cancro del colon-retto , cancro allo stomaco e altri. Anche nel nostro studio "Expression of the Molecules of the Major Histocompatibility Complex class II-HLA-DR in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck" (ID 2222) i ricercatori hanno potuto verificare che le cellule epiteliali neoplastiche del carcinoma a cellule squamose di la testa e il collo acquisiscono la capacità di esprimere HLA-DR (dati non mostrati, in corso del lavoro scientifico da presentare alla rivista con Impact Factor e della tesi finale di dottorato in Neuroscienze della dottoranda Chiara Prampolini). In alcuni tipi di tumori, l'espressione di HLA-DR è correlata alla presenza di cellule immunitarie come le cellule mieloidi macrofagi CD16+/CD11c, associate ad una buona prognosi e le cellule T che, richiamate nel tessuto danneggiato, determinano così la formazione di un tumore immunogenico. microambiente che potrebbe così supportare una risposta immunitaria antitumorale. Pertanto, la variabilità nell'espressione delle molecole HLA-DR spiegherebbe il diverso coinvolgimento immunitario nella sede del tumore e condizionerebbe la capacità dell'ospite di arginare la progressione del tumore.

Un ruolo fondamentale nella progressione del tumore è il microambiente, sul quale si stanno concentrando sempre più studi. Il microambiente tumorale è caratterizzato da diverse popolazioni cellulari, tra le quali la popolazione più abbondante è rappresentata dai fibroblasti associati al tumore (CAF). I CAF sono fibroblasti che, in contesto tumorale, assumono un fenotipo simile a quello dei mio-fibroblasti e si distinguono dai fibroblasti normali per una maggiore espressione di α-sma, FAP e FSP-1, che rappresentano i loro marcatori specifici, nonché per una maggiore espressione di vimentina, fibronectina e collagene di tipo XI. Numerose evidenze in diversi tipi di tumori hanno riportato sia il ruolo immunosoppressivo, in quanto queste cellule sono capaci in vitro di inibire la proliferazione dei linfociti T, di favorirne l'apoptosi o di indurre il fenotipo dei linfociti T regolatori; e il ruolo pro-tumorale, poiché sono in grado di promuovere la proliferazione e l'invasione tumorale, l'angiogenesi e la metastasi, contribuendo così al peggioramento della prognosi.

Molti studi stanno indirizzando la loro ricerca su quali fattori secreti dai CAF siano responsabili della loro funzione. In particolare, tra i tanti fattori secreti dai CAF, ci sono le interleuchine IL-17 e IL-33 che, come è stato dimostrato, possono indurre l'attivazione di molecole HLA-DR su cellule mesenchimali derivate dal midollo osseo. Sembra quindi interessante indagare il ruolo di HLA-DR in relazione alla presenza del microambiente tumorale rappresentato dai CAF. dello studio OBIETTIVI DELLO STUDIO Obiettivo primario dello studio

• Isolare colture di cellule epiteliali tumorali e di fibroblasti associati al cancro (CAF) da campioni di tessuto patologici e sani di pazienti con carcinoma primario a cellule squamose della testa e del collo Obiettivi secondari dello studio
• Studiare l'espressione di HLA-DR nelle colture cellulari ottenute. Pazienti arruolati e metodi di arruolamento Calcolo della dimensione del campione Il calcolo della dimensione del campione è stato effettuato utilizzando la Power Analysis, ritenendo accettabile un errore di primo tipo pari al 5% con una potenza di test del 90%, quindi un errore di secondo tipo del 10%. Per determinare il delta, differenza minima accettabile da rilevare tra i due gruppi a confronto (gruppo A: tessuto sano; gruppo B: tessuto patologico) e la deviazione standard relativa alle popolazioni in esame, sono stati seguiti i calcoli dell'effect size linee guida proposte da Choen.

Pazienti Saranno inclusi nello studio quattro pazienti con carcinoma primario a cellule squamose della testa e del collo ricoverati per trattamento chirurgico presso la Clinica di Otorinolaringoiatria, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Roma, nell'anno 2020-2021.

Dei 4 casi considerati saranno disponibili:

• Dati clinici
• Consenso informato
• Campione di tessuto tumorale
• Campione di tessuto non tumorale prelevato da materiale rimosso chirurgicamente durante l'intervento chirurgico

Consenso informato I soggetti coinvolti nello studio saranno invitati a leggere la scheda informativa del progetto e a firmare personalmente il consenso informato per l'utilizzo a fini di ricerca del materiale biologico e dei dati clinici da loro conservati.

Materiale organico Per ogni paziente incluso nello studio verrà prelevata una biopsia sia dal tessuto patologico che dal tessuto sano asportato durante l'intervento terapeutico, utilizzato come controllo. Entrambe le biopsie verranno coltivate.

5. Disegno dello studio Lo studio è senza scopo di lucro, monocentrico e si compone di due fasi. La durata prevista dello studio è di 12 mesi.

I FASE:

Selezione delle popolazioni cellulari

Attraverso specifici terreni di coltura verranno selezionati:

• Cellule epiteliali da biopsia sana e cellule epiteliali tumorali da biopsia tumorale mantenute in coltura con: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penicillina-streptomicina 1%, L-glutammina 1%, insulina 10μg/ml, EGF 20ng /ml, Idrocortisone 0,5 µg/ml;
• Fibroblasti da biopsia sana e fibroblasti associati al tumore (CAF) da biopsia tumorale mantenuti in coltura con: DMEM High Glucose, FBS 10%, penicillina-streptomicina 1%, L-glutammina 1%. Sia i fibroblasti che i CAF saranno isolati rispettivamente da colture di cellule epiteliali e tumorali, con una serie di passaggi in trypsin-EDTA 0,25%

Le popolazioni cellulari ottenute dalla biopsia sana (cellule epiteliali sane e fibroblasti) verranno utilizzate come controllo negativo.

FASE II: Valutazione dell'espressione di HLA-DR nelle cellule epiteliali tumorali e nei CAF tumorali. La positività HLA-DR sarà valutata mediante doppia analisi di immunofluorescenza con l'aggiunta di un marcatore epiteliale (citocheratina), oltre alla valutazione della presenza di classiche molecole costimolatorie (CD80, CD86).

Le cellule tumorali HLA-DR+ che non esprimono le molecole costimolatorie verranno stimolate in coltura con la somministrazione di IFN-ɣ e LPS, al fine di indurne l'espressione.

Analisi statistica I confronti tra i dati categorici (tessuto sano e patologico) saranno effettuati mediante il test del chi quadrato o il test esatto di Fisher, ove appropriato. Tutti i test saranno a due code e un alfa <0,05 sarà considerato statisticamente significativo.