Studie van HLA-DR in celculturen geïsoleerd uit primair plaveiselcelcarcinoom

Verschillende onderzoeken hebben een correlatie aangetoond tussen de expressie op tumorcellen van MHC II-moleculen (major histocompatibility complex class II), in het bijzonder van HLA-DR-moleculen (human luekocyte antigen), en de klinische uitkomst van de ziekte. Er is inderdaad waargenomen dat tumorcellen onder inflammatoire stimulatie van IFN-γ in staat worden gesteld MHC II-moleculen tot expressie te brengen die functioneren als niet-professionele APC's (antigeenpresenterende cellen). De APC-cellen zijn verantwoordelijk voor het presenteren van het antigeen aan de T-lymfocyten, waardoor hun activering wordt geïnduceerd, wat noodzakelijkerwijs de aanwezigheid van twee signalen vereist: het eerste geïnduceerd door de MHC-moleculen (MHC klasse II voor CD4+-lymfocyten) en het tweede geïnduceerd door co-stimulerende moleculen. CD80 of CD86, zonder welke lymfocyten een staat van anergie ondergaan.

Hoewel de rol van de expressie van deze moleculen op neoplastische cellen nog steeds zeer controversieel blijft, is er in verschillende onderzoeken naar verschillende soorten tumoren een positieve associatie tussen HLA-DR-expressie en klinische uitkomst gerapporteerd: bij plaveiselcelcarcinoom van het strottenhoofd, colorectale kanker , maagkanker en anderen. Ook in onze studie "Expression of the Molecules of the Major Histocompatibility Complex class II-HLA-DR in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck" (ID 2222) konden de onderzoekers verifiëren dat de neoplastische epitheelcellen van plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek verwerven het vermogen om HLA-DR tot expressie te brengen (gegevens niet getoond, in uitvoering van het wetenschappelijke werk dat moet worden gepresenteerd aan het tijdschrift met impactfactor en van het laatste proefschrift in neurowetenschappen van promovendus Chiara Prampolini). Bij sommige soorten tumoren correleert de expressie van HLA-DR met de aanwezigheid van immuuncellen zoals CD16+/CD11c-macrofaag-myeloïde cellen, geassocieerd met een goede prognose, en T-cellen die, teruggeroepen in beschadigd weefsel, aldus de vorming van een immunogene stof bepalen. micro-omgeving die zo een antitumorale immuunrespons zou kunnen ondersteunen. Daarom zou de variabiliteit in de expressie van HLA-DR-moleculen de verschillende immuunbetrokkenheid op de tumorplaats verklaren en het vermogen van de gastheer om de tumorprogressie te stoppen bepalen.

Een fundamentele rol bij de progressie van tumoren is de micro-omgeving, waarop steeds meer onderzoeken zich concentreren. De micro-omgeving van de tumor wordt gekenmerkt door verschillende celpopulaties, waarvan de meest voorkomende populatie wordt vertegenwoordigd door tumor-geassocieerde fibroblasten (CAF). CAF's zijn fibroblasten die, in een tumorcontext, een fenotype aannemen dat vergelijkbaar is met dat van myo-fibroblasten en die te onderscheiden zijn van normale fibroblasten door een grotere expressie van α-sma, FAP en FSP-1, die hun specifieke markers vertegenwoordigen, evenals een grotere expressie van vimentine, fibronectine en type XI collageen. Talrijke bewijzen bij verschillende soorten tumoren hebben zowel de immunosuppressieve rol gerapporteerd, aangezien deze cellen in vitro in staat zijn de proliferatie van T-lymfocyten te remmen, hun apoptose te bevorderen of het fenotype van regulerende T-lymfocyten te induceren; en de pro-tumorrol, aangezien ze in staat zijn tumorproliferatie en -invasie, angiogenese en metastase te bevorderen, waardoor ze bijdragen aan de verslechtering van de prognose.

Veel onderzoeken richten hun onderzoek op de factoren die door CAF's worden uitgescheiden en die verantwoordelijk zijn voor hun functie. Onder de vele factoren die door CAF's worden uitgescheiden, bevinden zich in het bijzonder de interleukinen IL-17 en IL-33 die, zoals is aangetoond, de activering van HLA-DR-moleculen op uit beenmerg afkomstige mesenchymale cellen kunnen induceren. Het lijkt daarom interessant om de rol van HLA-DR te onderzoeken in relatie tot de aanwezigheid van de micro-omgeving van de tumor die wordt vertegenwoordigd door CAF's. van het onderzoek DOELSTELLINGEN VAN HET ONDERZOEK Primaire doelstelling van het onderzoek

• Isoleer tumorepitheel- en kanker-geassocieerde fibroblast (CAF) celculturen uit pathologische en gezonde weefselmonsters van patiënten met primair plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek. Secundaire doelstellingen van het onderzoek
• Om de expressie van HLA-DR in de verkregen celculturen te onderzoeken. Ingeschreven patiënten en inschrijvingsmethoden Berekening van de steekproefomvang De berekening van de steekproefomvang werd uitgevoerd met behulp van Power Analysis, waarbij een eerste typefout gelijk aan 5% aanvaardbaar werd geacht met een testpower van 90%, dus een tweede typefout van 10%. Om de delta, het minimaal acceptabele verschil dat moet worden gedetecteerd tussen de twee groepen die worden vergeleken (groep A: gezond weefsel; groep B: pathologisch weefsel) en de standaarddeviatie met betrekking tot de onderzochte populaties te bepalen, werden de berekeningen van de effectgrootte gevolgd. richtlijnen voorgesteld door Choen.

Patiënten Vier patiënten met primair plaveiselcelcarcinoom van het hoofd-halsgebied die in het jaar 2020-2021 zijn opgenomen voor een chirurgische behandeling in de Otolaryngologiekliniek, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Rome, zullen in het onderzoek worden opgenomen.

Van de vier onderzochte gevallen zal beschikbaar zijn:

• Klinische gegevens
• Geïnformeerde toestemming
• Tumorweefselmonster
• Niet-tumorweefselmonster genomen van materiaal dat tijdens de operatie operatief is verwijderd

Geïnformeerde toestemming De proefpersonen die bij het onderzoek betrokken zijn, worden uitgenodigd om het projectinformatieblad te lezen en persoonlijk de geïnformeerde toestemming te ondertekenen voor het gebruik van hun opgeslagen biologische materiaal en klinische gegevens voor onderzoeksdoeleinden.

Organisch materiaal Voor elke patiënt die aan het onderzoek deelneemt, wordt een biopsie genomen van zowel het pathologische weefsel als van het gezonde weefsel dat tijdens de therapeutische operatie is verwijderd, ter controle. Beide biopsieën zullen worden gekweekt.

5. Studieontwerp Het onderzoek is een non-profit, single-center dat uit twee fasen bestaat. De verwachte duur van het onderzoek bedraagt ​​12 maanden.

Ik FASE:

Selectie van celpopulaties

Via specifieke kweekmedia wordt geselecteerd:

• Epitheelcellen uit gezonde biopsie en tumorepitheelcellen uit tumorbiopsie in kweek gehouden met: DMEM Hoge Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penicilline-streptomycine 1%, L-glutamine 1%, insuline 10 µg/ml, EGF 20ng /ml, Hydrocortison 0,5 µg/ml;
• Fibroblasten uit gezonde biopsie en tumorgeassocieerde fibroblasten (CAF) uit tumorbiopsie in cultuur gehouden met: DMEM hoge glucose, FBS 10%, penicilline-streptomycine 1%, L-glutamine 1%. Zowel fibroblasten als CAF's zullen worden geïsoleerd uit respectievelijk epitheel- en tumorcelculturen, met een reeks passages in trypsine-EDTA 0,25%

Celpopulaties uit de gezonde biopsie (gezonde epitheelcellen en fibroblasten) zullen als negatieve controle worden gebruikt.

FASE II: Evaluatie van HLA-DR-expressie in tumorepitheelcellen en tumor-CAF's De HLA-DR-positiviteit zal worden geëvalueerd door dubbele immunofluorescentieanalyse met de toevoeging van een epitheliale marker (cytokeratine), naast de evaluatie van de aanwezigheid van klassieke co-stimulerende moleculen (CD80, CD86).

HLA-DR+-tumorcellen die de co-stimulerende moleculen niet tot expressie brengen, zullen in kweek worden gestimuleerd met de toediening van IFN-ɣ en LPS, om hun expressie te induceren.

Statistische analyse Vergelijkingen tussen categorische gegevens (gezond en pathologisch weefsel) zullen worden gemaakt met behulp van de chikwadraattoets of de Fisher's exact-toets, waar van toepassing. Alle tests zijn tweezijdig en een alfa <0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.