Étude de HLA-DR dans des cultures cellulaires isolées du carcinome épidermoïde primitif

Plusieurs études ont démontré une corrélation entre l'expression sur les cellules tumorales de molécules du CMH II (complexe majeur d'histocompatibilité de classe II), notamment des molécules HLA-DR (antigène des luecocytaires humains), et l'évolution clinique de la maladie. En effet, il a été observé que les cellules tumorales sous stimulation inflammatoire de l'IFN-γ deviennent capables d'exprimer des molécules du CMH II fonctionnant comme des APC (cellules présentatrices d'antigène) non professionnelles. Les cellules APC se chargent de présenter l'antigène aux lymphocytes T, induisant ainsi leur activation, ce qui nécessite nécessairement la présence de deux signaux : le premier induit par les molécules du CMH (CMH classe II pour les lymphocytes CD4+) et le second induit par les molécules costimulatrices. CD80 ou CD86, sans lesquels les lymphocytes subissent un état d'anergie.

Bien que le rôle de l'expression de ces molécules sur les cellules néoplasiques reste encore très controversé, une association positive entre l'expression de HLA-DR et le résultat clinique a été rapportée par plusieurs études sur différents types de tumeurs : dans le carcinome épidermoïde du larynx, le cancer colorectal. , cancer de l'estomac et autres. Également dans notre étude « Expression des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II-HLA-DR dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou » (ID 2222), les enquêteurs ont pu vérifier que les cellules épithéliales néoplasiques du carcinome épidermoïde de la tête et le cou acquièrent la capacité d'exprimer HLA-DR (données non présentées, en cours de travail scientifique à présenter à la revue avec facteur d'impact et de la thèse de doctorat finale en neurosciences de la doctorante Chiara Prampolini). Dans certains types de tumeurs, l'expression de HLA-DR est corrélée à la présence de cellules immunitaires telles que les cellules myéloïdes macrophages CD16+/CD11c, associées à un bon pronostic et aux lymphocytes T qui, rappelés dans les tissus lésés, déterminent ainsi la formation d'un agent immunogène. microenvironnement qui pourrait ainsi favoriser une réponse immunitaire anti-tumorale. Ainsi, la variabilité de l'expression des molécules HLA-DR expliquerait les différentes implications immunitaires au niveau du site tumoral et conditionnerait la capacité de l'hôte à endiguer la progression tumorale.

Le microenvironnement, sur lequel se concentrent de plus en plus d’études, joue un rôle fondamental dans la progression tumorale. Le microenvironnement tumoral est caractérisé par différentes populations cellulaires, parmi lesquelles la population la plus abondante est représentée par les fibroblastes associés aux tumeurs (CAF). Les CAF sont des fibroblastes qui, dans un contexte tumoral, assument un phénotype similaire à celui des myo-fibroblastes et se distinguent des fibroblastes normaux par une plus grande expression de α-sma, FAP et FSP-1, qui représentent leurs marqueurs spécifiques, ainsi que une plus grande expression de vimentine, de fibronectine et de collagène de type XI. De nombreuses preuves dans différents types de tumeurs ont rapporté à la fois le rôle immunosuppresseur, puisque ces cellules sont capables in vitro d'inhiber la prolifération des lymphocytes T, de favoriser leur apoptose ou d'induire le phénotype des lymphocytes T régulateurs ; et le rôle pro-tumoral, car ils sont capables de favoriser la prolifération et l'invasion tumorales, l'angiogenèse et les métastases, contribuant ainsi à l'aggravation du pronostic.

De nombreuses études orientent leurs recherches sur les facteurs sécrétés par les CAF qui sont responsables de leur fonction. En particulier, parmi les nombreux facteurs sécrétés par les CAF, on trouve les interleukines IL-17 et IL-33 qui, comme cela a été démontré, peuvent induire l'activation de molécules HLA-DR sur les cellules mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse. Il semble donc intéressant d’étudier le rôle de HLA-DR en relation avec la présence du microenvironnement tumoral représenté par les CAF. de l'étude OBJECTIFS DE L'ÉTUDE Objectif principal de l'étude

• Isoler les cultures de cellules épithéliales tumorales et de fibroblastes associés au cancer (CAF) à partir d'échantillons de tissus pathologiques et sains provenant de patients atteints d'un carcinome épidermoïde primitif de la tête et du cou. Objectifs secondaires de l'étude
• Étudier l'expression de HLA-DR dans les cultures cellulaires obtenues. Patients inscrits et modalités d'enrôlement Calcul de la taille de l'échantillon Le calcul de la taille de l'échantillon a été effectué par analyse de puissance, jugeant acceptable une erreur de premier type égale à 5% avec une puissance de test de 90%, donc une erreur de deuxième type de 10%. Pour déterminer le delta, la différence minimale acceptable à détecter entre les deux groupes comparés (groupe A : tissu sain ; groupe B : tissu pathologique) et l'écart type relatif aux populations examinées, les calculs de taille d'effet ont été suivis. lignes directrices proposées par Choen.

Patients Quatre patients atteints d'un carcinome épidermoïde primitif de la tête et du cou admis pour un traitement chirurgical à la Clinique d'oto-rhino-laryngologie, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Rome, en 2020-2021 sera inclus dans l'étude.

Parmi les 4 cas considérés seront disponibles :

• Donnée clinique
• Consentement éclairé
• Échantillon de tissu tumoral
• Échantillon de tissu non tumoral prélevé à partir d'un matériau retiré chirurgicalement pendant l'intervention chirurgicale

Consentement éclairé Les sujets impliqués dans l'étude seront invités à lire la fiche d'information du projet et à signer personnellement le consentement éclairé pour l'utilisation de leur matériel biologique stocké et de leurs données cliniques à des fins de recherche.

Matériel organique Pour chaque patient inclus dans l'étude, une biopsie sera réalisée à la fois du tissu pathologique et du tissu sain prélevé lors de la chirurgie thérapeutique, utilisé comme contrôle. Les deux biopsies seront cultivées.

5. Conception de l'étude L'étude est une étude monocentrique à but non lucratif qui comprend deux phases. La durée prévue de l'étude est de 12 mois.

PHASE I :

Sélection des populations cellulaires

A travers des milieux de culture spécifiques seront sélectionnés :

• Cellules épithéliales issues de biopsies saines et cellules épithéliales tumorales issues de biopsies tumorales maintenues en culture avec : DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10 %, pénicilline-streptomycine 1 %, L-glutamine 1 %, insuline 10 µg/ml, EGF 20 ng /ml, Hydrocortisone 0,5 µg/ml ;
• Fibroblastes issus d'une biopsie saine et fibroblastes associés à une tumeur (CAF) issus d'une biopsie tumorale maintenus en culture avec : DMEM High Glucose, FBS 10 %, pénicilline-streptomycine 1 %, L-glutamine 1 %. Les fibroblastes et les CAF seront isolés respectivement de cultures de cellules épithéliales et tumorales avec une série de passages dans de la trypsine-EDTA à 0,25 %

Les populations cellulaires de la biopsie saine (cellules épithéliales et fibroblastes sains) seront utilisées comme contrôle négatif.

PHASE II : Évaluation de l'expression de HLA-DR dans les cellules épithéliales tumorales et les CAF tumoraux. La positivité de HLA-DR sera évaluée par double analyse d'immunofluorescence avec l'ajout d'un marqueur épithélial (cytokératine), en plus de l'évaluation de la présence de molécules co-stimulatrices classiques. (CD80, CD86).

Les cellules tumorales HLA-DR+ n'exprimant pas les molécules co-stimulatrices seront stimulées en culture avec l'administration d'IFN-ɣ et de LPS, afin d'induire leur expression.

Analyse statistique Les comparaisons entre les données catégorielles (tissus sains et pathologiques) seront effectuées par test du chi carré ou test exact de Fisher, le cas échéant. Tous les tests seront bilatéraux et un alpha <0,05 sera considéré comme statistiquement significatif.