Estudo de HLA-DR em culturas celulares isoladas de carcinoma espinocelular primário

Vários estudos demonstraram uma correlação entre a expressão em células tumorais de moléculas MHC II (complexo principal de histocompatibilidade classe II), em particular de moléculas HLA-DR (antígeno luecocitário humano), e o resultado clínico da doença. De facto, foi observado que as células tumorais sob estimulação inflamatória de IFN-γ tornam-se capazes de expressar moléculas de MHC II funcionando como APCs (células apresentadoras de antigénios) não profissionais. As células APC são responsáveis ​​por apresentar o antígeno aos linfócitos T, induzindo assim a sua ativação, o que requer necessariamente a presença de dois sinais: o primeiro induzido pelas moléculas do MHC (MHC classe II para linfócitos CD4+) e o segundo induzido pelas moléculas coestimulatórias. CD80 ou CD86, sem os quais os linfócitos passam por um estado de anergia.

Embora o papel da expressão destas moléculas nas células neoplásicas ainda permaneça altamente controverso, uma associação positiva entre a expressão de HLA-DR e o resultado clínico tem sido relatada por vários estudos sobre vários tipos de tumores: no carcinoma espinocelular da laringe, no cancro colorrectal , câncer de estômago e outros. Também em nosso estudo "Expressão das Moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade classe II-HLA-DR no Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço" (ID 2222) os pesquisadores conseguiram verificar que as células epiteliais neoplásicas do carcinoma espinocelular de a cabeça e o pescoço adquirem a capacidade de expressar HLA-DR (dados não apresentados, em andamento do trabalho científico a ser apresentado à revista com fator de impacto e da tese final de doutorado em Neurociências da doutoranda Chiara Prampolini). Em alguns tipos de tumores, a expressão de HLA-DR correlaciona-se com a presença de células imunitárias, como células mielóides macrófagas CD16+/CD11c, associadas a um bom prognóstico e células T que, recuperadas em tecido danificado, determinam assim a formação de um agente imunogénico. microambiente que poderia assim apoiar uma resposta imune antitumoral. Portanto, a variabilidade na expressão de moléculas HLA-DR explicaria o diferente envolvimento imunológico no local do tumor e condicionaria a capacidade do hospedeiro de conter a progressão do tumor.

Um papel fundamental na progressão do tumor é o microambiente, no qual cada vez mais estudos se concentram. O microambiente tumoral é caracterizado por diferentes populações celulares, dentre as quais a população mais abundante é representada por fibroblastos associados a tumores (CAF). Os CAF são fibroblastos que, num contexto tumoral, assumem um fenótipo semelhante ao dos miofibroblastos e distinguem-se dos fibroblastos normais pela maior expressão de α-sma, FAP e FSP-1, que representam os seus marcadores específicos, bem como maior expressão de vimentina, fibronectina e colágeno tipo XI. Numerosas evidências em diferentes tipos de tumores têm relatado tanto o papel imunossupressor, pois essas células são capazes in vitro de inibir a proliferação de linfócitos T, de favorecer sua apoptose ou de induzir o fenótipo de linfócitos T reguladores; e o papel pró-tumoral, pois são capazes de promover proliferação e invasão tumoral, angiogênese e metástase, contribuindo assim para a piora do prognóstico.

Muitos estudos estão direcionando suas pesquisas sobre quais fatores secretados pelos CAFs são responsáveis ​​por sua função. Em particular, entre os muitos factores segregados pelos CAFs, existem as interleucinas IL-17 e IL-33 que, como foi demonstrado, podem induzir a activação de moléculas HLA-DR em células mesenquimais derivadas da medula óssea. Parece, portanto, interessante investigar o papel do HLA-DR em relação à presença do microambiente tumoral representado pelos CAFs. do estudo OBJETIVOS DO ESTUDO Objetivo principal do estudo

• Isolar culturas de células epiteliais tumorais e de fibroblastos associados ao câncer (CAF) de amostras de tecidos patológicos e saudáveis ​​de pacientes com carcinoma espinocelular primário de cabeça e pescoço Objetivos secundários do estudo
• Investigar a expressão de HLA-DR nas culturas celulares obtidas. Pacientes cadastrados e métodos de inscrição Cálculo do tamanho da amostra O cálculo do tamanho da amostra foi realizado por meio de Power Analysis, considerando aceitável um erro de primeiro tipo igual a 5% com poder de teste de 90%, portanto um erro de segundo tipo de 10%. Para determinar o delta, a diferença mínima aceitável a ser detectada entre os dois grupos comparados (grupo A: tecido saudável; grupo B: tecido patológico) e o desvio padrão relativo às populações examinadas, foram seguidos os cálculos do tamanho do efeito diretrizes propostas por Choen.

Pacientes Quatro pacientes com carcinoma espinocelular primário de cabeça e pescoço internados para tratamento cirúrgico na Clínica de Otorrinolaringologia, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Roma, no ano 2020-2021 serão incluídos no estudo.

Dos 4 casos considerados estarão disponíveis:

• Dados clínicos
• Consentimento informado
• Amostra de tecido tumoral
• Amostra de tecido não tumoral retirada de material removido cirurgicamente durante a cirurgia

Consentimento informado Os sujeitos envolvidos no estudo serão convidados a ler a ficha de informações do projeto e a assinar pessoalmente o consentimento informado para o uso de seu material biológico armazenado e dados clínicos para fins de pesquisa.

Material orgânico Para cada paciente incluído no estudo, será realizada uma biópsia tanto do tecido patológico quanto do tecido saudável retirado durante a cirurgia terapêutica, utilizado como controle. Ambas as biópsias serão cultivadas.

5. Desenho do estudo O estudo é sem fins lucrativos, de centro único, que consiste em duas fases. A duração prevista do estudo é de 12 meses.

EU FASE:

Seleção de populações celulares

Através de meios de cultura específicos serão selecionados:

• Células epiteliais de biópsia saudável e células epiteliais tumorais de biópsia tumoral mantidas em cultura com: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penicilina-estreptomicina 1%, L-glutamina 1%, insulina 10µg/ml, EGF 20ng /ml, Hidrocortisona 0,5µg/ml;
• Fibroblastos de biópsia saudável e fibroblastos associados a tumor (CAF) de biópsia de tumor mantidos em cultura com: DMEM High Glucose, FBS 10%, penicilina-estreptomicina 1%, L-glutamina 1%. Tanto os fibroblastos quanto os CAFs serão isolados de culturas de células epiteliais e tumorais, respectivamente, com uma série de passagens em tripsina-EDTA 0,25%

Populações de células da biópsia saudável (células epiteliais saudáveis ​​e fibroblastos) serão utilizadas como controle negativo.

FASE II: Avaliação da expressão de HLA-DR em células epiteliais tumorais e CAFs tumorais A positividade para HLA-DR será avaliada por análise de dupla imunofluorescência com adição de marcador epitelial (citoqueratina), além da avaliação da presença de moléculas coestimulatórias clássicas (CD80, CD86).

Células tumorais HLA-DR+ que não expressam as moléculas coestimuladoras serão estimuladas em cultura com administração de IFN-ɣ e LPS, a fim de induzir sua expressão.

Análise estatística As comparações entre dados categóricos (tecido saudável e patológico) serão feitas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher, quando apropriado. Todos os testes serão bicaudais e um alfa <0,05 será considerado estatisticamente significativo.