Studie av HLA-DR i cellkulturer isolerade från primärt skivepitelcancer

Flera studier har visat en korrelation mellan uttrycket på tumörceller av MHC II (major histocompatibility complex class II) molekyler, i synnerhet av HLA-DR (human luekocyte antigen) molekyler, och det kliniska resultatet av sjukdomen. Det har faktiskt observerats att tumörceller under inflammatorisk stimulering av IFN-y blir kapabla att uttrycka MHC II-molekyler som fungerar som icke-professionella APC:er (antigenpresenterande celler). APC-cellerna är ansvariga för att presentera antigenet för T-lymfocyterna, vilket inducerar deras aktivering, vilket nödvändigtvis kräver närvaron av två signaler: den första inducerad av MHC-molekylerna (MHC klass II för CD4+-lymfocyter) och den andra inducerad av Costimulatory molekyler CD80 eller CD86, utan vilka lymfocyter genomgår ett tillstånd av anergi.

Även om rollen för uttrycket av dessa molekyler på neoplastiska celler fortfarande är mycket kontroversiell, har ett positivt samband mellan HLA-DR-uttryck och kliniskt resultat rapporterats av flera studier på olika typer av tumörer: i skivepitelcancer i struphuvudet, kolorektal cancer , magcancer och andra. Även i vår studie "Expression of the Molecules of the Major Histocompatibility Complex class II-HLA-DR in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck" (ID 2222) kunde forskarna verifiera att de neoplastiska epitelcellerna av skivepitelcancer av huvudet och nacken skaffar sig förmågan att uttrycka HLA-DR (data visas inte, pågår av det vetenskapliga arbetet som ska presenteras för tidskriften med impact factor och av doktoranden Chiara Prampolinis slutliga doktorsavhandling i neurovetenskap). I vissa typer av tumörer korrelerar uttrycket av HLA-DR med närvaron av immunceller såsom CD16+/CD11c makrofagmyeloidceller, associerade med en god prognos och T-celler som, återkallade i skadad vävnad, således bestämmer bildandet av en immunogen mikromiljö som därmed skulle kunna stödja ett antitumörimmunsvar . Därför skulle variabiliteten i uttrycket av HLA-DR-molekyler förklara det olika immunengagemanget i tumörstället och skulle betinga värdens förmåga att stoppa tumörprogression.

En grundläggande roll i tumörprogression är mikromiljön, som allt fler studier fokuserar på. Tumörmikromiljön kännetecknas av olika cellpopulationer, bland vilka den vanligaste populationen representeras av tumörassocierade fibroblaster (CAF). CAF är fibroblaster som i ett tumörsammanhang antar en fenotyp som liknar myofibroblaster och som kan särskiljas från normala fibroblaster genom ett större uttryck av α-sma, FAP och FSP-1, som representerar deras specifika markörer, samt ett större uttryck av vimentin, fibronektin och typ XI kollagen. Talrika bevis i olika typer av tumörer har rapporterat både den immunsuppressiva rollen, eftersom dessa celler är kapabla att in vitro hämma proliferationen av T-lymfocyter, att gynna deras apoptos eller att inducera fenotypen av regulatoriska T-lymfocyter; och protumörrollen, eftersom de är kapabla att främja tumörproliferation och invasion, angiogenes och metastaser, och därmed bidra till försämringen av prognosen.

Många studier riktar sin forskning om vilka faktorer som utsöndras av CAF som är ansvariga för deras funktion. I synnerhet, bland de många faktorer som utsöndras av CAFs, finns interleukinerna IL-17 och IL-33 som, som det har visats, kan inducera aktiveringen av HLA-DR-molekyler på benmärgshärledda mesenkymala celler. Det verkar därför intressant att undersöka rollen av HLA-DR i förhållande till närvaron av tumörmikromiljön som representeras av CAF. av studien MÅL FÖR STUDIEN Studiens primära mål

• Isolera tumörepitel- och cancerassocierade fibroblastcellkulturer (CAF) från patologiska och friska vävnadsprover från patienter med primär skivepitelcancer i huvud och nacke Sekundära syften med studien
• För att undersöka uttrycket av HLA-DR i de erhållna cellkulturerna. Rekryterade patienter och inskrivningsmetoder Beräkning av urvalsstorleken Beräkningen av urvalsstorleken utfördes med hjälp av Power Analysis, vilket ansåg acceptabelt ett första typfel lika med 5 % med en teststyrka på 90 %, därför ett andra typfel på 10 %. För att bestämma deltat, den minsta acceptabla skillnaden som ska detekteras mellan de två grupperna som jämförs (grupp A: frisk vävnad; grupp B: patologisk vävnad) och standardavvikelsen avseende de undersökta populationerna, följdes beräkningarna av effektstorleken riktlinjer föreslagna av Choen.

Patienter Fyra patienter med primärt skivepitelcancer i huvud och nacke inlagda för kirurgisk behandling på Otolaryngology Clinic, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Rom, år 2020-2021 kommer att inkluderas i studien.

Av de fyra övervägda fallen kommer att vara tillgängliga:

• Kliniska data
• Informerat samtycke
• Tumörvävnadsprov
• Icke-tumörvävnadsprov taget från material som avlägsnats kirurgiskt under operationen

Informerat samtycke De försökspersoner som är involverade i studien kommer att uppmanas att läsa projektets informationsblad och att personligen underteckna det informerade samtycket för användning av deras lagrade biologiska material och kliniska data för forskningsändamål.

Organiskt material För varje patient som ingår i studien kommer en biopsi att tas både från den patologiska vävnaden och från den friska vävnaden som tagits bort under den terapeutiska operationen, använd som kontroll. Båda biopsierna kommer att odlas.

5. Studiedesign Studien är ett ideellt, singelcenter som består av två faser. Studiens förväntade varaktighet är 12 månader.

JAG FASER:

Urval av cellpopulationer

Genom specifika kulturmedier kommer att väljas:

• Epitelceller från frisk biopsi och tumörepitelceller från tumörbiopsi hålls i odling med: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penicillin-streptomycin 1%, L-glutamin 1%, insulin 10µg/ml, EGF 20ng /ml, hydrokortison 0,5 µg/ml;
• Fibroblaster från frisk biopsi och tumörassocierade fibroblaster (CAF) från tumörbiopsi upprätthållna i odling med: DMEM High Glucose, FBS 10%, penicillin-streptomycin 1%, L-glutamin 1%. Både fibroblaster och CAF kommer att isoleras från epitel- respektive tumörcellskulturer med en serie passager i trypsin-EDTA 0,25 %

Cellpopulationer från den friska biopsien (friska epitelceller och fibroblaster) kommer att användas som negativ kontroll.

FAS II: Utvärdering av HLA-DR-uttryck i tumörepitelceller och tumör-CAFs HLA-DR-positivitet kommer att utvärderas genom dubbel immunofluorescensanalys med tillägg av en epitelmarkör (cytokeratin), utöver utvärderingen av förekomsten av klassiska samstimulerande molekyler (CD80, CD86).

HLA-DR+-tumörceller som inte uttrycker de samstimulerande molekylerna kommer att stimuleras i kultur med administrering av IFN-ɣ och LPS, för att inducera deras uttryck.

Statistisk analys Jämförelser mellan kategoriska data (frisk och patologisk vävnad) kommer att göras med chi-kvadrattest eller Fishers exakta test, där så är lämpligt. Alla tester kommer att vara tvåsidiga och en alfa <0,05 kommer att anses vara statistiskt signifikant.