Studie av HLA-DR i cellekulturer isolert fra primær plateepitelkarsinom

Flere studier har vist en korrelasjon mellom uttrykket på tumorceller av MHC II (major histocompatibility complex class II) molekyler, spesielt av HLA-DR (human luekocyte antigen) molekyler, og det kliniske resultatet av sykdommen. Det har faktisk blitt observert at tumorceller under inflammatorisk stimulering av IFN-y blir i stand til å uttrykke MHC II-molekyler som fungerer som ikke-profesjonelle APC-er (antigenpresenterende celler). APC-cellene er ansvarlige for å presentere antigenet til T-lymfocyttene, og dermed indusere deres aktivering, noe som nødvendigvis krever tilstedeværelse av to signaler: det første indusert av MHC-molekylene (MHC klasse II for CD4+ lymfocytter) og det andre indusert av Costimulatory molekyler CD80 eller CD86, uten hvilke lymfocytter gjennomgår en tilstand av anergi.

Selv om rollen til uttrykket av disse molekylene på neoplastiske celler fortsatt er svært kontroversiell, har en positiv sammenheng mellom HLA-DR-ekspresjon og klinisk utfall blitt rapportert av flere studier på ulike typer svulster: i plateepitelkarsinom i strupehodet, kolorektal kreft , magekreft og andre. Også i vår studie "Expression of the Molecules of the Major Histocompatibility Complex class II-HLA-DR in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck" (ID 2222) var etterforskerne i stand til å verifisere at de neoplastiske epitelcellene til plateepitelkarsinom av hodet og nakken tilegner seg evnen til å uttrykke HLA-DR (data ikke vist, under pågående av det vitenskapelige arbeidet som skal presenteres for tidsskrift med impact factor og av den endelige doktorgradsavhandlingen i nevrovitenskap til PhD-studenten Chiara Prampolini). I noen typer svulster korrelerer uttrykket av HLA-DR med tilstedeværelsen av immunceller som CD16+/CD11c makrofag myeloidceller, assosiert med en god prognose og T-celler som, tilbakekalt i skadet vev, dermed bestemmer dannelsen av et immunogent vev. mikromiljø som dermed kan støtte en anti-tumor immunrespons. Derfor vil variasjonen i uttrykket av HLA-DR-molekyler forklare den forskjellige immuninvolveringen i tumorstedet og vil betinge vertens evne til å demme opp for tumorprogresjon.

En grunnleggende rolle i tumorprogresjon er mikromiljøet, som flere og flere studier fokuserer på. Tumormikromiljøet er preget av forskjellige cellepopulasjoner, blant hvilke den mest tallrike befolkningen er representert av tumorassosierte fibroblaster (CAF). CAF-er er fibroblaster som i en tumorsammenheng antar en fenotype som ligner på myo-fibroblaster og kan skilles fra normale fibroblaster ved et større uttrykk av α-sma, FAP og FSP-1, som representerer deres spesifikke markører, samt et større uttrykk for vimentin, fibronektin og type XI kollagen. Tallrike bevis i forskjellige typer svulster har rapportert både den immunsuppressive rollen, da disse cellene er i stand til in vitro å hemme spredningen av T-lymfocytter, for å favorisere deres apoptose eller å indusere fenotypen til regulatoriske T-lymfocytter; og protumor-rollen, da de er i stand til å fremme tumorproliferasjon og -invasjon, angiogenese og metastase, og dermed bidra til forverring av prognosen.

Mange studier retter sin forskning på hvilke faktorer som skilles ut av CAFs som er ansvarlige for deres funksjon. Spesielt, blant de mange faktorene som skilles ut av CAF, er det interleukinene IL-17 og IL-33 som, som det har blitt demonstrert, kan indusere aktivering av HLA-DR-molekyler på benmargsavledede mesenkymale celler. Det virker derfor interessant å undersøke rollen til HLA-DR i forhold til tilstedeværelsen av tumormikromiljøet representert av CAF-er. av studiet MÅL FOR STUDIEN Primært mål for studiet

• Isoler tumorepitel- og kreftassosiert fibroblast (CAF) cellekulturer fra patologiske og friske vevsprøver fra pasienter med primær plateepitelkarsinom i hode og nakke Sekundære mål med studien
• For å undersøke uttrykket av HLA-DR i de oppnådde cellekulturene. Registrerte pasienter og registreringsmetoder Beregning av prøvestørrelsen Beregningen av prøvestørrelsen ble utført ved bruk av Power Analysis, og anså akseptabel en første type feil lik 5 % med en teststyrke på 90 %, derfor en andre type feil på 10 %. For å bestemme deltaet, den minste akseptable forskjellen som skal påvises mellom de to gruppene som sammenlignes (gruppe A: friskt vev; gruppe B: patologisk vev) og standardavviket knyttet til populasjonene som ble undersøkt, ble beregningene av effektstørrelsen fulgt retningslinjer foreslått av Choen.

Pasienter Fire pasienter med primær plateepitelkarsinom i hode og nakke innlagt for kirurgisk behandling ved Otolaryngology Clinic, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Roma, i år 2020-2021 vil bli inkludert i studien.

Av de 4 sakene som vurderes vil være tilgjengelige:

• Kliniske data
• Informert samtykke
• Tumorvevsprøve
• Ikke-tumor vevsprøve tatt fra materiale kirurgisk fjernet under operasjonen

Informert samtykke Forsøkspersonene som er involvert i studien vil bli invitert til å lese prosjektinformasjonsarket og personlig signere det informerte samtykket for bruk av deres lagrede biologiske materiale og kliniske data til forskningsformål.

Organisk materiale For hver pasient som inngår i studien vil det bli tatt en biopsi både fra det patologiske vevet og fra det friske vevet som ble fjernet under den terapeutiske operasjonen, brukt som kontroll. Begge biopsiene skal dyrkes.

5. Studiedesign Studiet er et non-profit, enkeltsenter som består av to faser. Forventet varighet av studien er 12 måneder.

JEG FASER:

Utvalg av cellepopulasjoner

Gjennom spesifikke kulturmedier vil bli valgt:

• Epitelceller fra frisk biopsi og tumorepitelceller fra tumorbiopsi holdt i kultur med: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penicillin-streptomycin 1%, L-glutamin 1%, insulin 10µg/ml, EGF 20ng /ml, hydrokortison 0,5 ug/ml;
• Fibroblaster fra frisk biopsi og tumorassosierte fibroblaster (CAF) fra tumorbiopsi holdt i kultur med: DMEM høy glukose, FBS 10 %, penicillin-streptomycin 1 %, L-glutamin 1 %. Både fibroblaster og CAF vil bli isolert fra henholdsvis epitel- og tumorcellekulturer med en serie passasjer i trypsin-EDTA 0,25 %

Cellepopulasjoner fra den friske biopsien (friske epitelceller og fibroblaster) vil bli brukt som negativ kontroll.

FASE II: Evaluering av HLA-DR-ekspresjon i tumorepitelceller og tumor-CAFs HLA-DR-positivitet vil bli evaluert ved dobbel immunofluorescensanalyse med tillegg av en epitelmarkør (cytokeratin), i tillegg til evaluering av tilstedeværelsen av klassiske costimulatoriske molekyler (CD80, CD86).

HLA-DR+ tumorceller som ikke uttrykker de costimulerende molekylene vil bli stimulert i kultur med administrering av IFN-ɣ og LPS, for å indusere deres ekspresjon.

Statistisk analyse Sammenligninger mellom kategoriske data (sunt og patologisk vev) vil bli gjort med kjikvadrattest eller Fishers eksakte test, der det er aktuelt. Alle tester vil være tosidede og en alfa <0,05 vil bli vurdert som statistisk signifikant.