Studie HLA-DR v buněčných kulturách izolovaných z primárního spinocelulárního karcinomu

Několik studií prokázalo korelaci mezi expresí molekul MHC II (hlavní histokompatibilní komplex třídy II) na nádorových buňkách, zejména molekul HLA-DR (lidský luekocytární antigen), a klinickým výsledkem onemocnění. Bylo skutečně pozorováno, že nádorové buňky se při zánětlivé stimulaci IFN-y stávají schopné exprimovat molekuly MHC II fungující jako neprofesionální APC (buňky prezentující antigen). APC buňky jsou zodpovědné za prezentaci antigenu T lymfocytům, čímž indukují jejich aktivaci, která nutně vyžaduje přítomnost dvou signálů: prvního indukovaného molekulami MHC (MHC třídy II pro CD4+ lymfocyty) a druhého indukovaného kostimulačními molekulami. CD80 nebo CD86, bez kterých lymfocyty procházejí stavem anergie.

Ačkoli role exprese těchto molekul na neoplastických buňkách stále zůstává vysoce kontroverzní, pozitivní souvislost mezi expresí HLA-DR a klinickým výsledkem byla hlášena v několika studiích na různých typech nádorů: u spinocelulárního karcinomu hrtanu, kolorektálního karcinomu , rakovina žaludku a další. Také v naší studii „Exprese molekul hlavního histokompatibilního komplexu třídy II-HLA-DR u spinocelulárního karcinomu hlavy a krku“ (ID 2222) byli vědci schopni ověřit, že neoplastické epiteliální buňky spinocelulárního karcinomu hlava a krk získávají schopnost vyjadřovat HLA-DR (data neuvedena, probíhá vědecká práce k předložení časopisu s impakt faktorem a závěrečná doktorandská práce v oboru Neuroscience doktorandky Chiary Prampolini). U některých typů nádorů exprese HLA-DR koreluje s přítomností imunitních buněk, jako jsou CD16+/CD11c makrofágové myeloidní buňky, spojené s dobrou prognózou, a T buňky, které, když se vybaví v poškozené tkáni, určují tvorbu imunogenní mikroprostředí, které by tak mohlo podporovat protinádorovou imunitní odpověď . Variabilita exprese molekul HLA-DR by tedy vysvětlovala různé imunitní zapojení v místě nádoru a podmiňovala by schopnost hostitele zastavit progresi nádoru.

Zásadní roli v progresi nádoru má mikroprostředí, na které se zaměřuje stále více studií. Nádorové mikroprostředí je charakterizováno různými buněčnými populacemi, z nichž nejhojnější populaci představují fibroblasty spojené s nádorem (CAF). CAF jsou fibroblasty, které v kontextu nádoru nabývají fenotypu podobného fenotypu myo-fibroblastů a jsou odlišitelné od normálních fibroblastů větší expresí α-sma, FAP a FSP-1, které představují jejich specifické markery, a také větší exprese vimentinu, fibronektinu a kolagenu typu XI. Četné důkazy u různých typů nádorů uvádějí jak imunosupresivní roli, protože tyto buňky jsou schopné in vitro inhibovat proliferaci T lymfocytů, podporovat jejich apoptózu nebo indukovat fenotyp regulačních T lymfocytů; a protumorovou roli, protože jsou schopny podporovat proliferaci a invazi nádoru, angiogenezi a metastázy, čímž přispívají ke zhoršení prognózy.

Mnoho studií zaměřuje svůj výzkum na to, které faktory vylučované CAF jsou zodpovědné za jejich funkci. Zejména mezi mnoha faktory vylučovanými CAF jsou interleukiny IL-17 a IL-33, které, jak bylo prokázáno, mohou indukovat aktivaci molekul HLA-DR na mezenchymálních buňkách odvozených z kostní dřeně. Zdá se tedy zajímavé zkoumat roli HLA-DR ve vztahu k přítomnosti nádorového mikroprostředí reprezentovaného CAF. studia CÍLE STUDIA Primární cíl studia

• Izolujte buněčné kultury nádorového epitelu a fibroblastů asociovaných s rakovinou (CAF) z patologických a zdravých vzorků tkáně od pacientů s primárním spinocelulárním karcinomem hlavy a krku Sekundární cíle studie
• Zkoumat expresi HLA-DR v získaných buněčných kulturách. Zařazení pacienti a metody zápisu Výpočet velikosti vzorku Výpočet velikosti vzorku byl proveden pomocí Power Analysis, za přijatelnou chybu prvního typu rovnou 5 % s testovací silou 90 %, tedy chybu druhého typu 10 %. Pro stanovení delta, minimálního přijatelného rozdílu, který má být detekován mezi dvěma srovnávanými skupinami (skupina A: zdravá tkáň; skupina B: patologická tkáň) a směrodatné odchylky týkající se zkoumaných populací, byly provedeny výpočty velikosti účinku. pokyny navržené Choenem.

Pacienti Do studie budou zařazeni čtyři pacienti s primárním spinocelulárním karcinomem hlavy a krku přijatí k chirurgické léčbě na Otolaryngologické klinice, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Řím, v roce 2020-2021.

Ze 4 uvažovaných případů budou k dispozici:

• Klinická data
• Informovaný souhlas
• Vzorek nádorové tkáně
• Vzorek nenádorové tkáně odebraný z materiálu chirurgicky odstraněného během operace

Informovaný souhlas Subjekty zapojené do studie budou vyzvány, aby si přečetly informační list projektu a osobně podepsaly informovaný souhlas s použitím jejich uloženého biologického materiálu a klinických dat pro výzkumné účely.

Organický materiál U každého pacienta zařazeného do studie bude odebrána biopsie jak z patologické tkáně, tak ze zdravé tkáně odebrané během terapeutického chirurgického zákroku, která se použije jako kontrola. Obě biopsie budou kultivovány.

5. Návrh studie Studie je neziskové, jediné centrum, které se skládá ze dvou fází. Předpokládaná délka studia je 12 měsíců.

FÁZÍM:

Selekce buněčných populací

Prostřednictvím konkrétních kultivačních médií budou vybrány:

• Epiteliální buňky ze zdravé biopsie a nádorové epiteliální buňky z biopsie nádoru udržované v kultuře s: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10 %, penicilin-streptomycin 1 %, L-glutamin 1 %, inzulín 10 ug/ml, EGF 20 ng /ml, hydrokortison 0,5 ug/ml;
• Fibroblasty ze zdravé biopsie a fibroblasty spojené s tumorem (CAF) z biopsie tumoru udržované v kultuře s: DMEM High Glucose, FBS 10 %, penicilin-streptomycin 1 %, L-glutamin 1 %. Jak fibroblasty, tak CAF budou izolovány z epiteliálních a nádorových buněčných kultur, v tomto pořadí, se sérií pasáží v trypsinu-EDTA 0,25 %

Buněčné populace ze zdravé biopsie (zdravé epiteliální buňky a fibroblasty) budou použity jako negativní kontrola.

FÁZE II: Hodnocení exprese HLA-DR v nádorových epiteliálních buňkách a nádorových CAF Pozitivita HLA-DR bude kromě hodnocení přítomnosti klasických kostimulačních molekul hodnocena dvojitou imunofluorescenční analýzou s přidáním epiteliálního markeru (cytokeratinu). (CD80, CD86).

Nádorové buňky HLA-DR+, které neexprimují kostimulační molekuly, budou stimulovány v kultuře podáváním IFN-ɣ a LPS, aby se indukovala jejich exprese.

Statistická analýza Srovnání mezi kategoriálními údaji (zdravá a patologická tkáň) bude provedeno chí-kvadrát testem nebo Fisherovým exaktním testem, kde je to vhodné. Všechny testy budou dvoustranné a hodnota alfa <0,05 bude považována za statisticky významnou.