原发性鳞状细胞癌细胞培养物中 HLA-DR 的研究

多项研究已证明肿瘤细胞上 MHC II（主要组织相容性复合物 II 类）分子，特别是 HLA-DR（人类白细胞抗原）分子的表达与疾病的临床结果之间存在相关性。 事实上，已经观察到肿瘤细胞在 IFN-γ 的炎症刺激下变得能够表达 MHC II 分子，起到非专业 APC（抗原呈递细胞）的作用。 APC 细胞负责将抗原呈递给 T 淋巴细胞，从而诱导其激活，这必然需要两个信号的存在：第一个由 MHC 分子（CD4+ 淋巴细胞的 MHC II 类）诱导，第二个由共刺激分子诱导CD80 或 CD86，没有它们，淋巴细胞就会处于无反应状态。

尽管这些分子的表达对肿瘤细胞的作用仍然存在很大争议，但多项针对各种类型肿瘤的研究报告了 HLA-DR 表达与临床结果之间的正相关：喉鳞状细胞癌、结直肠癌、胃癌等。 同样在我们的研究“头颈鳞状细胞癌中主要组织相容性复合物 II 类-HLA-DR 的分子表达”(ID 2222) 中，研究人员能够验证鳞状细胞癌的肿瘤上皮细胞头部和颈部获得表达 HLA-DR 的能力（数据未显示，正在向具有影响因子的期刊提交的科学工作以及博士生 Chiara Prampolini 的神经科学最终博士论文的进展中）。 在某些类型的肿瘤中，HLA-DR 的表达与免疫细胞（例如 CD16+/CD11c 巨噬细胞骨髓细胞）的存在相关，与良好的预后相关；而 T 细胞则在受损组织中被召回，从而决定免疫原性的形成。因此可以支持抗肿瘤免疫反应的微环境。 因此，HLA-DR分子表达的变异性可以解释肿瘤部位的不同免疫参与，并调节宿主阻止肿瘤进展的能力。

肿瘤进展中的一个基本作用是微环境，越来越多的研究正在关注这一点。 肿瘤微环境以不同的细胞群为特征，其中最丰富的细胞群是肿瘤相关成纤维细胞（CAF）。 CAF 是成纤维细胞，在肿瘤环境中，呈现与肌成纤维细胞相似的表型，并且通过 α-sma、FAP 和 FSP-1 的更高表达（代表其特定标记物）与正常成纤维细胞区分开来。波形蛋白、纤连蛋白和 XI 型胶原蛋白的表达量更高。 不同类型肿瘤中的大量证据报道了免疫抑制作用，因为这些细胞能够在体外抑制 T 淋巴细胞的增殖，促进其凋亡或诱导调节性 T 淋巴细胞的表型；以及促肿瘤作用，因为它们能够促进肿瘤增殖和侵袭、血管生成和转移，从而导致预后恶化。

许多研究正在研究 CAF 分泌的哪些因子负责其功能。 特别是，在CAF分泌的众多因子中，有白介素IL-17和IL-33，已被证明可以诱导骨髓间充质细胞上HLA-DR分子的激活。 因此，研究 HLA-DR 与以 CAF 为代表的肿瘤微环境的存在相关的作用似乎很有趣。研究内容 研究目的 研究的主要目的

• 从头颈部原发性鳞状细胞癌患者的病理和健康组织样本中分离肿瘤上皮细胞和癌症相关成纤维细胞 (CAF) 细胞培养物 研究的次要目标
• 研究获得的细胞培养物中HLA-DR的表达。 入组患者和入组方法 样本量的计算 使用功效分析进行样本量的计算，在检验功效为 90% 的情况下，认为等于 5% 的第一类误差是可以接受的，因此 10% 的第二类误差是可以接受的。 为了确定 delta、所比较的两组之间要检测到的最小可接受差异（A 组：健康组织；B 组：病理组织）以及与所检查人群相关的标准偏差，遵循效应大小的计算Choen 提出的指导方针。

患者 2020-2021 年在罗马 IRCCS Fondazione Policlinico Gemelli 耳鼻喉科诊所接受手术治疗的 4 名原发性头颈部鳞状细胞癌患者将纳入该研究。

在考虑的 4 个案例中，将提供：

• 临床数据
• 知情同意
• 肿瘤组织样本
• 从手术期间手术切除的材料中获取的非肿瘤组织样本

知情同意 参与研究的受试者将被邀请阅读项目信息表并亲自签署知情同意书，同意将其存储的生物材料和临床数据用于研究目的。

有机材料 对于参与研究的每位患者，将从病理组织和治疗手术期间切除的健康组织中进行活检，用作对照。 两次活检都将被培​​养。

5. 研究设计 该研究是一个非营利性、单中心的研究，由两个阶段组成。 研究预计持续时间为 12 个月。

我阶段：

细胞群的选择

通过特定的培养基将被选择：

• 来自健康活检的上皮细胞和来自肿瘤活检的肿瘤上皮细胞维持在培养物中：DMEM高葡萄糖+HAM'S F12 1:1，FBS 10%，青霉素-链霉素1%，L-谷氨酰胺1%，胰岛素10μg/ml，EGF 20ng /ml，氢化可的松0.5μg/ml；
• 来自健康活检的成纤维细胞和来自肿瘤活检的肿瘤相关成纤维细胞 (CAF) 维持在以下培养基中：DMEM 高葡萄糖、FBS 10%、青霉素-链霉素 1%、L-谷氨酰胺 1%。 成纤维细胞和 CAF 将分别从上皮细胞和肿瘤细胞培养物中分离，并在胰蛋白酶-EDTA 0.25% 中进行一系列传代

来自健康活检的细胞群（健康上皮细胞和成纤维细胞）将用作阴性对照。

第二阶段：评估肿瘤上皮细胞和肿瘤 CAF 中的 HLA-DR 表达 除了评估经典共刺激分子的存在之外，还将通过添加上皮标记物（细胞角蛋白）的双重免疫荧光分析来评估 HLA-DR 阳性（CD80、CD86）。

不表达共刺激分子的 HLA-DR+ 肿瘤细胞将在培养物中通过施用 IFN-ɣ 和 LPS 进行刺激，以诱导其表达。

统计分析 分类数据（健康组织和病理组织）之间的比较将在适当的情况下通过卡方检验或费舍尔精确检验进行。 所有检验都将是双尾的，并且 alpha <0.05 将被认为具有统计显着性。