Undersøgelse af HLA-DR i cellekulturer isoleret fra primært planocellulært karcinom

Adskillige undersøgelser har vist en sammenhæng mellem ekspressionen på tumorceller af MHC II (major histocompatibility complex class II) molekyler, især af HLA-DR (human luekocyte antigen) molekyler, og det kliniske resultat af sygdommen. Det er faktisk blevet observeret, at tumorceller under inflammatorisk stimulering af IFN-y bliver i stand til at udtrykke MHC II-molekyler, der fungerer som ikke-professionelle APC'er (antigenpræsenterende celler). APC-cellerne er ansvarlige for at præsentere antigenet for T-lymfocytterne og inducerer dermed deres aktivering, hvilket nødvendigvis kræver tilstedeværelsen af ​​to signaler: det første induceret af MHC-molekylerne (MHC klasse II for CD4+ lymfocytter) og det andet induceret af Costimulatory molekyler CD80 eller CD86, uden hvilke lymfocytter undergår en tilstand af anergi.

Selvom rollen af ​​ekspressionen af ​​disse molekyler på neoplastiske celler stadig er meget kontroversiel, er en positiv sammenhæng mellem HLA-DR-ekspression og klinisk resultat blevet rapporteret af adskillige undersøgelser af forskellige typer af tumorer: i pladecellekarcinom i strubehovedet, kolorektal cancer , mavekræft og andre. Også i vores undersøgelse "Expression of the Molecules of the Major Histocompatibility Complex class II-HLA-DR in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck" (ID 2222) var efterforskerne i stand til at verificere, at de neoplastiske epitelceller af pladecellecarcinom af hoved og nakke opnår evnen til at udtrykke HLA-DR (data ikke vist, i gang med det videnskabelige arbejde, der skal præsenteres for tidsskrift med impact factor og af den afsluttende ph.d.-afhandling i neurovidenskab af ph.d.-studerende Chiara Prampolini). I nogle typer tumorer korrelerer ekspressionen af ​​HLA-DR med tilstedeværelsen af ​​immunceller såsom CD16+/CD11c makrofag myeloidceller, forbundet med en god prognose og T-celler, som, tilbagekaldt i beskadiget væv, således bestemmer dannelsen af ​​et immunogent stof. mikromiljø, som således kunne understøtte et anti-tumor immunrespons. Derfor ville variabiliteten i ekspressionen af ​​HLA-DR-molekyler forklare den forskellige immuninvolvering i tumorstedet og ville betinge værtens evne til at dæmme op for tumorprogression.

En grundlæggende rolle i tumorprogression er mikromiljøet, som flere og flere undersøgelser fokuserer på. Tumormikromiljøet er karakteriseret ved forskellige cellepopulationer, blandt hvilke den mest udbredte population er repræsenteret af tumorassocierede fibroblaster (CAF). CAF'er er fibroblaster, som i en tumorsammenhæng antager en fænotype svarende til myo-fibroblaster og kan skelnes fra normale fibroblaster ved et større udtryk af α-sma, FAP og FSP-1, som repræsenterer deres specifikke markører, samt en større ekspression af vimentin, fibronectin og type XI kollagen. Talrige beviser i forskellige typer af tumorer har rapporteret både den immunsuppressive rolle, da disse celler er i stand til in vitro at inhibere proliferationen af ​​T-lymfocytter, at favorisere deres apoptose eller at inducere fænotypen af ​​regulatoriske T-lymfocytter; og protumor-rollen, da de er i stand til at fremme tumorproliferation og -invasion, angiogenese og metastase, og dermed bidrage til forværringen af ​​prognosen.

Mange undersøgelser retter deres forskning på, hvilke faktorer udskilt af CAF'er er ansvarlige for deres funktion. Blandt de mange faktorer, der udskilles af CAF'er, er der især interleukinerne IL-17 og IL-33, som, som det er blevet påvist, kan inducere aktiveringen af ​​HLA-DR-molekyler på knoglemarvs-afledte mesenkymale celler. Det virker derfor interessant at undersøge HLA-DR's rolle i forhold til tilstedeværelsen af ​​tumormikromiljøet repræsenteret af CAF'er. af undersøgelsen MÅL FOR UNDERSØGELSEN Undersøgelsens primære formål

• Isoler tumorepitel- og cancerassocierede fibroblastcellekulturer (CAF) fra patologiske og sunde vævsprøver fra patienter med primært planocellulært karcinom i hoved og hals Sekundære formål med undersøgelsen
• At undersøge ekspressionen af ​​HLA-DR i de opnåede cellekulturer. Tilmeldte patienter og tilmeldingsmetoder Beregning af stikprøvestørrelsen Beregningen af ​​stikprøvestørrelsen blev udført ved hjælp af Power Analysis, idet man anså en første typefejl på 5 % med en teststyrke på 90 %, derfor en anden typefejl på 10 %. For at bestemme deltaet, den mindste acceptable forskel, der skal påvises mellem de to grupper, der sammenlignes (gruppe A: sundt væv; gruppe B: patologisk væv) og standardafvigelsen vedrørende de undersøgte populationer, blev beregningerne af effektstørrelsen fulgt retningslinjer foreslået af Choen.

Patienter Fire patienter med primært planocellulært karcinom i hoved og hals indlagt til kirurgisk behandling på Otolaryngology Clinic, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Rom, i år 2020-2021 vil blive inkluderet i undersøgelsen.

Af de 4 behandlede sager vil være tilgængelige:

• Kliniske data
• Informeret samtykke
• Tumorvævsprøve
• Ikke-tumorvævsprøve taget fra materiale fjernet kirurgisk under operationen

Informeret samtykke De personer, der er involveret i undersøgelsen, vil blive inviteret til at læse projektets informationsark og personligt underskrive det informerede samtykke til brug af deres lagrede biologiske materiale og kliniske data til forskningsformål.

Organisk materiale For hver patient, der indgår i undersøgelsen, vil der blive taget en biopsi både fra det patologiske væv og fra det raske væv, der blev fjernet under den terapeutiske operation, brugt som kontrol. Begge biopsier vil blive dyrket.

5. Undersøgelsesdesign Undersøgelsen er et non-profit, enkeltcenter, der består af to faser. Den forventede varighed af undersøgelsen er 12 måneder.

I FASE:

Udvælgelse af cellepopulationer

Gennem specifikke kulturmedier vil blive udvalgt:

• Epitelceller fra rask biopsi og tumorepitelceller fra tumorbiopsi holdt i kultur med: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penicillin-streptomycin 1%, L-glutamin 1%, insulin 10µg/ml, EGF 20ng /ml, hydrocortison 0,5 µg/ml;
• Fibroblaster fra rask biopsi og tumorassocierede fibroblaster (CAF) fra tumorbiopsi holdt i kultur med: DMEM High Glucose, FBS 10%, penicillin-streptomycin 1%, L-glutamin 1%. Både fibroblaster og CAF'er vil blive isoleret fra henholdsvis epitel- og tumorcellekulturer med en række passager i trypsin-EDTA 0,25%

Cellepopulationer fra den raske biopsi (raske epitelceller og fibroblaster) vil blive brugt som negativ kontrol.

FASE II: Evaluering af HLA-DR-ekspression i tumorepitelceller og tumor-CAF'er HLA-DR-positivitet vil blive evalueret ved dobbelt immunofluorescensanalyse med tilføjelse af en epitelmarkør (cytokeratin), udover evalueringen af ​​tilstedeværelsen af ​​klassiske costimulerende molekyler (CD80, CD86).

HLA-DR+ tumorceller, der ikke udtrykker de costimulerende molekyler, vil blive stimuleret i kultur med administration af IFN-ɣ og LPS for at inducere deres ekspression.

Statistisk analyse Sammenligninger mellem kategoriske data (sundt og patologisk væv) vil blive foretaget ved chi-square test eller Fishers eksakte test, hvor det er relevant. Alle tests vil være to-halede, og en alfa <0,05 vil blive betragtet som statistisk signifikant.