Badanie HLA-DR w hodowlach komórkowych izolowanych z pierwotnego raka płaskonabłonkowego

W kilku badaniach wykazano korelację między ekspresją na komórkach nowotworowych cząsteczek MHC II (główny kompleks zgodności tkankowej klasy II), w szczególności cząsteczek HLA-DR (ludzki antygen luekocytowy), a klinicznym wynikiem choroby. Rzeczywiście, zaobserwowano, że komórki nowotworowe pod wpływem zapalnej stymulacji IFN-γ stają się zdolne do ekspresji cząsteczek MHC II, funkcjonujących jako nieprofesjonalne APC (komórki prezentujące antygen). Komórki APC odpowiadają za prezentację antygenu limfocytom T, indukując w ten sposób ich aktywację, co koniecznie wymaga obecności dwóch sygnałów: pierwszego indukowanego przez cząsteczki MHC (MHC klasy II dla limfocytów CD4+) i drugiego indukowanego przez cząsteczki kostymulujące CD80 lub CD86, bez których limfocyty przechodzą w stan anergii.

Chociaż rola ekspresji tych cząsteczek na komórkach nowotworowych nadal pozostaje wysoce kontrowersyjna, w kilku badaniach dotyczących różnych typów nowotworów wykazano pozytywny związek między ekspresją HLA-DR a wynikami klinicznymi: w raku płaskonabłonkowym krtani, raku jelita grubego , raka żołądka i inne. Również w naszym badaniu „Ekspresja cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II-HLA-DR w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi” (ID 2222) badaczom udało się zweryfikować, że nowotworowe komórki nabłonkowe raka płaskonabłonkowego głowa i szyja nabywają zdolność do ekspresji HLA-DR (dane nie pokazane, w toku prac naukowych, które mają zostać zaprezentowane w czasopiśmie z Impact Factor oraz końcowej pracy doktorskiej z neurologii doktorantki Chiary Prampolini). W niektórych typach nowotworów ekspresja HLA-DR koreluje z obecnością komórek układu odpornościowego, takich jak komórki szpikowe makrofagów CD16+/CD11c, co wiąże się z dobrym rokowaniem, oraz limfocytów T, które, przypomniane w uszkodzonej tkance, determinują w ten sposób tworzenie immunogennego przeciwciała. mikrośrodowisko, które mogłoby w ten sposób wspierać przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną. Zatem zmienność w ekspresji cząsteczek HLA-DR wyjaśniałaby różne zaangażowanie układu immunologicznego w miejscu guza i warunkowałaby zdolność gospodarza do powstrzymywania progresji nowotworu.

Zasadniczą rolę w progresji nowotworu odgrywa mikrośrodowisko, na którym skupia się coraz więcej badań. Mikrośrodowisko nowotworu charakteryzują się różnymi populacjami komórek, wśród których najliczniejszą populację reprezentują fibroblasty związane z nowotworem (CAF). CAF to fibroblasty, które w kontekście nowotworu przyjmują fenotyp podobny do miofibroblastów i odróżniają się od normalnych fibroblastów większą ekspresją α-sma, FAP i FSP-1, które reprezentują ich specyficzne markery, a także większą ekspresję wimentyny, fibronektyny i kolagenu typu XI. Liczne dowody dotyczące różnych typów nowotworów wskazują zarówno na rolę immunosupresyjną, ponieważ komórki te są zdolne in vitro do hamowania proliferacji limfocytów T, jak i do sprzyjania ich apoptozie lub do indukowania fenotypu regulatorowych limfocytów T; oraz rolę pronowotworową, ponieważ mogą sprzyjać proliferacji i inwazji nowotworu, angiogenezie i przerzutom, przyczyniając się w ten sposób do pogorszenia rokowania.

Wiele badań kieruje swoje badania nad tym, które czynniki wydzielane przez CAF są odpowiedzialne za ich funkcję. W szczególności wśród wielu czynników wydzielanych przez CAF znajdują się interleukiny IL-17 i IL-33, które, jak wykazano, mogą indukować aktywację cząsteczek HLA-DR na komórkach mezenchymalnych pochodzących ze szpiku kostnego. Dlatego interesujące wydaje się zbadanie roli HLA-DR w odniesieniu do obecności mikrośrodowiska nowotworu reprezentowanego przez CAF. CELE BADANIA Główny cel badania

• Izolowanie hodowli komórek nabłonka nowotworowego i fibroblastów związanych z nowotworem (CAF) z próbek patologicznych i zdrowych tkanek od pacjentów z pierwotnym rakiem płaskonabłonkowym głowy i szyi. Drugorzędne cele badania
• Zbadanie ekspresji HLA-DR w uzyskanych hodowlach komórkowych. Pacjenci włączeni do badania i metody rekrutacji Obliczenie wielkości próby Obliczenie wielkości próby przeprowadzono za pomocą analizy mocy, uznając za akceptowalny błąd pierwszego rodzaju równy 5% przy mocy testu 90%, a zatem błąd drugiego typu wynoszący 10%. Aby wyznaczyć deltę, minimalną akceptowalną różnicę do wykrycia pomiędzy porównywanymi grupami (grupa A: tkanka zdrowa; grupa B: tkanka patologiczna) oraz odchylenie standardowe odnoszące się do badanych populacji, przeprowadzono obliczenia wielkości efektu wytyczne zaproponowane przez Choena.

Pacjenci Badaniem objętych zostanie czterech pacjentów z pierwotnym rakiem płaskonabłonkowym głowy i szyi przyjętych do leczenia operacyjnego w Klinice Otolaryngologii Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS w Rzymie w latach 2020-2021.

Z 4 rozpatrywanych przypadków dostępne będą:

• Dane kliniczne
• Świadoma zgoda
• Próbka tkanki nowotworowej
• Próbka tkanki nienowotworowej pobrana z materiału usuniętego chirurgicznie podczas operacji

Świadoma zgoda Osoby biorące udział w badaniu zostaną poproszone o zapoznanie się z arkuszem informacyjnym projektu i osobiste podpisanie świadomej zgody na wykorzystanie ich przechowywanego materiału biologicznego i danych klinicznych do celów badawczych.

Materiał organiczny U każdego pacjenta objętego badaniem zostanie pobrana biopsja zarówno tkanki patologicznej, jak i tkanki zdrowej usuniętej podczas zabiegu leczniczego, stanowiącej kontrolę. Obie biopsje zostaną poddane hodowli.

5. Projekt badania Badanie ma charakter non-profit, jest prowadzone w jednym ośrodku i składa się z dwóch etapów. Przewidywany czas trwania badania wynosi 12 miesięcy.

I FAZA:

Selekcja populacji komórek

Za pośrednictwem konkretnych podłoży hodowlanych wybrane zostaną:

• Komórki nabłonkowe ze zdrowej biopsji oraz komórki nabłonka nowotworu z biopsji guza utrzymywane w hodowli z dodatkiem: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penicylina-streptomycyna 1%, L-glutamina 1%, insulina 10µg/ml, EGF 20ng /ml, hydrokortyzon 0,5 µg/ml;
• Fibroblasty ze zdrowej biopsji i fibroblasty związane z nowotworem (CAF) z biopsji guza utrzymywane w hodowli z: DMEM High Glucose, FBS 10%, penicylina-streptomycyna 1%, L-glutamina 1%. Zarówno fibroblasty, jak i CAF zostaną wyizolowane odpowiednio z hodowli komórek nabłonkowych i nowotworowych, poprzez serię pasaży w 0,25% trypsynie-EDTA

Populacje komórek ze zdrowej biopsji (zdrowe komórki nabłonkowe i fibroblasty) zostaną użyte jako kontrola negatywna.

FAZA II: Ocena ekspresji HLA-DR w komórkach nabłonka nowotworu i CAF guza Dodatni wynik pod względem HLA-DR zostanie oceniony za pomocą podwójnej analizy immunofluorescencyjnej z dodatkiem markera nabłonkowego (cytokeratyny), oprócz oceny obecności klasycznych cząsteczek kostymulujących (CD80, CD86).

Komórki nowotworowe HLA-DR+, które nie wyrażają cząsteczek kostymulujących, będą stymulowane w hodowli poprzez podanie IFN-ɣ i LPS, w celu wywołania ich ekspresji.

Analiza statystyczna Porównania danych kategorycznych (tkanka zdrowa i patologiczna) zostaną dokonane za pomocą testu chi-kwadrat lub, w stosownych przypadkach, dokładnego testu Fishera. Wszystkie testy będą dwustronne, a wartość alfa <0,05 będzie uznawana za statystycznie istotną.