HLA-DR vizsgálata primer laphámsejtes karcinómából izolált sejtkultúrákban

Számos tanulmány kimutatta az MHC II (II. osztályú fő hisztokompatibilitási komplex) molekulák, különösen a HLA-DR (humán leukocita antigén) molekulák tumorsejteken történő expressziója és a betegség klinikai kimenetele közötti összefüggést. Valójában megfigyelték, hogy az IFN-γ gyulladásos stimulációja alatt álló daganatsejtek képesek MHC II-molekulák expresszálására, amelyek nem professzionális APC-ként (antigénprezentáló sejtek) működnek. Az APC sejtek felelősek az antigén bemutatásáért a T-limfociták számára, így azok aktiválódását indukálják, amihez szükségszerűen két jel jelenléte szükséges: az elsőt az MHC-molekulák indukálják (MHC II. osztályú CD4+ limfociták), a másodikat pedig a kostimuláló molekulák. CD80 vagy CD86, amelyek nélkül a limfociták anergiás állapotba kerülnek.

Bár ezeknek a molekuláknak a neoplasztikus sejteken való expressziójának szerepe továbbra is erősen ellentmondásos, a HLA-DR expresszió és a klinikai kimenetel közötti pozitív összefüggésről számoltak be számos, különböző típusú daganatokon végzett tanulmány: a gége laphámsejtes karcinómájában, vastagbélrákban. , gyomorrák és mások. Szintén „A II-HLA-DR fő hisztokompatibilitási komplex molekuláinak expressziója fej-nyaki laphámsejtes karcinómában” (ID 2222) című tanulmányunkban a kutatók ellenőrizni tudták, hogy a a fej és a nyak elsajátítja a HLA-DR expressziójának képességét (az adatok nem jelennek meg, az impakt faktoros folyóiratban bemutatandó tudományos munka és Chiara Prampolini PhD-hallgató idegtudományi záródolgozatának folyamatában). Egyes daganattípusokban a HLA-DR expressziója korrelál az immunsejtek, például a CD16+/CD11c makrofág mieloid sejtek jelenlétével, amelyek jó prognózishoz kapcsolódnak, valamint a T-sejtekhez, amelyek a sérült szövetből visszahívva meghatározzák az immunogén sejt kialakulását. mikrokörnyezet, amely így támogathatja a daganatellenes immunválaszt. Ezért a HLA-DR molekulák expressziójának változékonysága megmagyarázná a tumor helyén való eltérő immunrendszeri érintettséget, és befolyásolná a gazdaszervezet azon képességét, hogy megállítsa a tumor progresszióját.

A daganat progressziójában alapvető szerepe van a mikrokörnyezetnek, amelyre egyre több tanulmány fókuszál. A tumor mikrokörnyezetét különböző sejtpopulációk jellemzik, amelyek közül a legelterjedtebb populációt a tumor-asszociált fibroblasztok (CAF) képviselik. A CAF-ok olyan fibroblasztok, amelyek daganatos összefüggésben a myo-fibroblasztokéhoz hasonló fenotípust vesznek fel, és megkülönböztethetők a normál fibroblasztoktól az α-sma, a FAP és az FSP-1 nagyobb expressziójával, amelyek a specifikus markereiket, valamint a vimentin, a fibronektin és a XI típusú kollagén nagyobb expressziója. Különböző típusú daganatok esetében számos bizonyíték számolt be az immunszuppresszív szerepről, mivel ezek a sejtek in vitro képesek a T-limfociták proliferációjának gátlására, apoptózisuk elősegítésére vagy a szabályozó T-limfociták fenotípusának indukálására; valamint a pro-tumor szerep, mivel képesek elősegíteni a tumor proliferációját és invázióját, az angiogenezist és a metasztázist, így hozzájárulva a prognózis romlásához.

Számos tanulmány irányítja kutatásaikat arra vonatkozóan, hogy a CAF-ek mely faktorai felelősek működésükért. A CAF-ek által szekretált számos faktor között különösen az IL-17 és IL-33 interleukinek találhatók, amelyek, amint azt kimutatták, képesek a HLA-DR molekulák aktiválását indukálni a csontvelőből származó mezenchimális sejteken. Ezért érdekesnek tűnik megvizsgálni a HLA-DR szerepét a CAF-ok által képviselt tumor mikrokörnyezet jelenlétében. A vizsgálat célja A vizsgálat elsődleges célja

• Tumor epiteliális és rákkal asszociált fibroblaszt (CAF) sejtkultúrák izolálása primer fej-nyaki laphámsejtes karcinómában szenvedő betegek kóros és egészséges szövetmintáiból A vizsgálat másodlagos céljai
• A HLA-DR expressziójának vizsgálata a kapott sejttenyészetekben. A bevont betegek és a felvételi módszerek A mintanagyság számítása A mintanagyság számítása Power Analysis segítségével történt, elfogadhatónak ítélve az 5%-os első típusú hibát 90%-os tesztteljesítmény mellett, ezért a második típusú hibát 10%-os. A delta, a két összehasonlítandó csoport (A csoport: egészséges szövet; B csoport: kóros szövet) és a vizsgált populációkra vonatkozó szórás között kimutatható minimálisan elfogadható különbség, a hatásméret számításait követték. Choen által javasolt irányelvek.

Betegek Négy fej-nyaki primer laphámsejtes karcinómában szenvedő beteget vesznek fel sebészeti kezelésre a Fondazione Policlinico Gemelli Fül-orr-gégészeti Klinikán, IRCCS, Róma, 2020-2021 között.

A vizsgált 4 esetből elérhető lesz:

• Klinikai adatok
• Tájékozott beleegyezés
• Daganatos szövetminta
• A műtét során sebészi úton eltávolított anyagból vett nem daganatos szövetminta

Tájékozott beleegyezés A vizsgálatban részt vevő alanyok felkérést kapnak, hogy olvassák el a projekt tájékoztatóját, és személyesen írják alá a tájékozott hozzájárulásukat tárolt biológiai anyagaik és klinikai adataik kutatási célú felhasználásához.

Szerves anyag Minden vizsgálatba bevont betegből biopsziát vesznek mind a kóros szövetből, mind a terápiás műtét során eltávolított egészséges szövetből, kontrollként használva. Mindkét biopsziát tenyésztjük.

5. A tanulmány felépítése A tanulmány egy non-profit, egyközpontú, amely két fázisból áll. A vizsgálat várható időtartama 12 hónap.

I. FÁZIS:

Sejtpopulációk kiválasztása

Egyedi táptalaj segítségével választják ki:

• Egészséges biopsziából származó hámsejtek és tumorbiopsziából származó tumor hámsejtek tenyészetben fenntartva: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penicillin-sztreptomicin 1%, L-glutamin 1%, inzulin 10 µg /ml, EGF 20 ng /ml, hidrokortizon 0,5 µg/ml;
• Egészséges biopsziából származó fibroblasztok és tumorbiopsziából származó tumor-asszociált fibroblasztok (CAF), amelyeket tenyészetben tartottunk fenn: DMEM High Glucose, FBS 10%, penicillin-sztreptomicin 1%, L-glutamin 1%. Mind a fibroblasztokat, mind a CAF-eket epiteliális sejttenyészetekből, illetve tumorsejt-tenyészetekből izoláljuk, 0,25%-os tripszin-EDTA-ban átoltva.

Az egészséges biopsziából származó sejtpopulációkat (egészséges hámsejteket és fibroblasztokat) használjuk negatív kontrollként.

II. FÁZIS: A HLA-DR expresszió értékelése tumor epiteliális sejtekben és tumor CAF-ekben A HLA-DR pozitivitást kettős immunfluoreszcencia analízissel értékeljük egy epiteliális marker (citokeratin) hozzáadásával, a klasszikus kostimuláló molekulák jelenlétének értékelése mellett. (CD80, CD86).

Azokat a HLA-DR+ tumorsejteket, amelyek nem expresszálják a kostimuláló molekulákat, tenyészetben IFN-ɣ és LPS adásával stimulálják, hogy expressziójukat indukálják.

Statisztikai elemzés A kategorikus adatok (egészséges és patológiás szövet) összehasonlítása khi-négyzet teszttel vagy Fisher-féle egzakt teszttel történik, ahol ez szükséges. Minden teszt kétirányú lesz, és az alfa <0,05 statisztikailag szignifikánsnak minősül.