Untersuchung von HLA-DR in Zellkulturen, die aus primärem Plattenepithelkarzinom isoliert wurden

Mehrere Studien haben einen Zusammenhang zwischen der Expression von MHC-II-Molekülen (Major Histocompatibility Complex Class II), insbesondere von HLA-DR-Molekülen (humanes Leukozytenantigen), auf Tumorzellen und dem klinischen Verlauf der Krankheit gezeigt. Tatsächlich wurde beobachtet, dass Tumorzellen unter entzündlicher Stimulation durch IFN-γ in der Lage werden, MHC-II-Moleküle zu exprimieren, die als nicht-professionelle APCs (Antigen-präsentierende Zellen) fungieren. Die APC-Zellen sind dafür verantwortlich, den T-Lymphozyten das Antigen zu präsentieren und so deren Aktivierung auszulösen, was notwendigerweise das Vorhandensein von zwei Signalen erfordert: das erste, das durch die MHC-Moleküle (MHC-Klasse II für CD4+-Lymphozyten) induziert wird, und das zweite, das durch kostimulatorische Moleküle induziert wird CD80 oder CD86, ohne die Lymphozyten einen Anergiezustand erfahren.

Obwohl die Rolle der Expression dieser Moleküle auf neoplastischen Zellen immer noch sehr umstritten ist, wurde in mehreren Studien zu verschiedenen Arten von Tumoren über einen positiven Zusammenhang zwischen der HLA-DR-Expression und dem klinischen Ergebnis berichtet: Plattenepithelkarzinom des Kehlkopfes und Darmkrebs , Magenkrebs und andere. Auch in unserer Studie „Expression of the Molecules of the Major Histocompatibility Complex class II-HLA-DR in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck“ (ID 2222) konnten die Forscher nachweisen, dass die neoplastischen Epithelzellen von Plattenepithelkarzinomen von Kopf und Hals erwerben die Fähigkeit, HLA-DR zu exprimieren (Daten nicht gezeigt, im Gange der wissenschaftlichen Arbeit, die der Zeitschrift mit Impact Factor vorgelegt werden soll, und der Abschlussarbeit der Doktorandin Chiara Prampolini in Neurowissenschaften). Bei einigen Tumorarten korreliert die Expression von HLA-DR mit dem Vorhandensein von Immunzellen wie CD16+/CD11c-Makrophagen-Myeloidzellen, die mit einer guten Prognose verbunden sind, und T-Zellen, die, wenn sie in geschädigtem Gewebe abgerufen werden, die Bildung eines Immunogens bestimmen Mikroumgebung, die somit eine Anti-Tumor-Immunantwort unterstützen könnte. Daher würde die Variabilität in der Expression von HLA-DR-Molekülen die unterschiedliche Immunbeteiligung an der Tumorstelle erklären und die Fähigkeit des Wirts beeinflussen, das Fortschreiten des Tumors einzudämmen.

Eine grundlegende Rolle bei der Tumorprogression spielt die Mikroumgebung, auf die sich immer mehr Studien konzentrieren. Die Mikroumgebung des Tumors ist durch unterschiedliche Zellpopulationen gekennzeichnet, von denen die am häufigsten vorkommende Population tumorassoziierte Fibroblasten (CAF) darstellt. CAFs sind Fibroblasten, die im Tumorkontext einen ähnlichen Phänotyp wie Myofibroblasten annehmen und sich von normalen Fibroblasten durch eine stärkere Expression von α-sma, FAP und FSP-1 unterscheiden, die ihre spezifischen Marker darstellen, sowie eine stärkere Expression von Vimentin, Fibronektin und Kollagen Typ XI. Zahlreiche Belege bei verschiedenen Tumortypen belegen sowohl die immunsuppressive Rolle, da diese Zellen in vitro in der Lage sind, die Proliferation von T-Lymphozyten zu hemmen, deren Apoptose zu begünstigen oder den Phänotyp regulatorischer T-Lymphozyten zu induzieren; und die pro-Tumor-Rolle, da sie die Tumorproliferation und -invasion, Angiogenese und Metastasierung fördern und so zur Verschlechterung der Prognose beitragen können.

Viele Studien richten ihre Forschung darauf, welche von CAFs abgesonderten Faktoren für ihre Funktion verantwortlich sind. Zu den vielen von CAFs sezernierten Faktoren zählen insbesondere die Interleukine IL-17 und IL-33, die nachweislich die Aktivierung von HLA-DR-Molekülen auf aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Zellen induzieren können. Es erscheint daher interessant, die Rolle von HLA-DR in Bezug auf das Vorhandensein der durch CAFs repräsentierten Tumormikroumgebung zu untersuchen. der Studie ZIELE DER STUDIE Hauptziel der Studie

• Isolieren Sie Zellkulturen von Tumorepithel und krebsassoziierten Fibroblasten (CAF) aus pathologischen und gesunden Gewebeproben von Patienten mit primärem Plattenepithelkarzinom im Kopf- und Halsbereich. Sekundäre Ziele der Studie
• Untersuchung der Expression von HLA-DR in den erhaltenen Zellkulturen. Eingeschriebene Patienten und Aufnahmemethoden Berechnung der Stichprobengröße Die Berechnung der Stichprobengröße wurde mithilfe der Power-Analyse durchgeführt, wobei ein Fehler erster Art von 5 % bei einer Teststärke von 90 % und somit ein Fehler zweiter Art von 10 % als akzeptabel erachtet wurde. Zur Bestimmung des Deltas, des minimalen akzeptablen Unterschieds, der zwischen den beiden verglichenen Gruppen (Gruppe A: gesundes Gewebe; Gruppe B: pathologisches Gewebe) festgestellt werden kann, und der Standardabweichung in Bezug auf die untersuchten Populationen wurden die Berechnungen der Effektgröße befolgt Von Choen vorgeschlagene Richtlinien.

Patienten Vier Patienten mit primärem Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses, die im Jahr 2020–2021 zur chirurgischen Behandlung in der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Rom, aufgenommen wurden, werden in die Studie einbezogen.

Von den 4 betrachteten Fällen werden verfügbar sein:

• Klinische Daten
• Einverständniserklärung
• Tumorgewebeprobe
• Nicht-tumoröse Gewebeprobe, entnommen aus Material, das während der Operation chirurgisch entfernt wurde

Einverständniserklärung Die an der Studie beteiligten Probanden werden eingeladen, das Projektinformationsblatt zu lesen und die Einverständniserklärung zur Nutzung ihres gespeicherten biologischen Materials und ihrer klinischen Daten für Forschungszwecke persönlich zu unterzeichnen.

Organisches Material Für jeden in die Studie einbezogenen Patienten wird eine Biopsie sowohl aus dem pathologischen Gewebe als auch aus dem gesunden Gewebe entnommen, das während der therapeutischen Operation entnommen und als Kontrolle verwendet wird. Beide Biopsien werden kultiviert.

5. Studiendesign Die Studie ist ein gemeinnütziges Einzelzentrum, das aus zwei Phasen besteht. Die voraussichtliche Studiendauer beträgt 12 Monate.

ICH PHASE:

Auswahl von Zellpopulationen

Durch spezifische Kulturmedien werden ausgewählt:

• Epithelzellen aus gesunden Biopsien und Tumorepithelzellen aus Tumorbiopsien, gehalten in Kultur mit: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10 %, Penicillin-Streptomycin 1 %, L-Glutamin 1 %, Insulin 10 µg/ml, EGF 20 ng /ml, Hydrocortison 0,5 µg/ml;
• Fibroblasten aus gesunden Biopsien und tumorassoziierte Fibroblasten (CAF) aus Tumorbiopsien, gehalten in Kultur mit: DMEM High Glucose, FBS 10 %, Penicillin-Streptomycin 1 %, L-Glutamin 1 %. Sowohl Fibroblasten als auch CAFs werden aus Epithel- bzw. Tumorzellkulturen mit einer Reihe von Passagen in Trypsin-EDTA 0,25 % isoliert.

Als Negativkontrolle werden Zellpopulationen aus der gesunden Biopsie (gesunde Epithelzellen und Fibroblasten) verwendet.

PHASE II: Bewertung der HLA-DR-Expression in Tumorepithelzellen und Tumor-CAFs. Die HLA-DR-Positivität wird zusätzlich zur Bewertung des Vorhandenseins klassischer kostimulatorischer Moleküle durch doppelte Immunfluoreszenzanalyse unter Zusatz eines Epithelmarkers (Cytokeratin) bewertet (CD80, CD86).

HLA-DR+-Tumorzellen, die die kostimulatorischen Moleküle nicht exprimieren, werden in Kultur durch die Verabreichung von IFN-ɣ und LPS stimuliert, um ihre Expression zu induzieren.

Statistische Analyse Vergleiche zwischen kategorialen Daten (gesundes und pathologisches Gewebe) werden gegebenenfalls anhand des Chi-Quadrat-Tests oder des exakten Fisher-Tests durchgeführt. Alle Tests sind zweiseitig und ein Alpha <0,05 wird als statistisch signifikant angesehen.