Estudio de HLA-DR en cultivos celulares aislados de carcinoma primario de células escamosas

Varios estudios han demostrado una correlación entre la expresión en las células tumorales de las moléculas MHC II (complejo mayor de histocompatibilidad de clase II), en particular de las moléculas HLA-DR (antígeno leucocitario humano), y el resultado clínico de la enfermedad. De hecho, se ha observado que las células tumorales bajo estimulación inflamatoria de IFN-γ se vuelven capaces de expresar moléculas MHC II que funcionan como APC (células presentadoras de antígenos) no profesionales. Las células APC son las encargadas de presentar el antígeno a los linfocitos T, induciendo así su activación, lo que requiere necesariamente la presencia de dos señales: la primera inducida por las moléculas MHC (MHC clase II para los linfocitos CD4+) y la segunda inducida por moléculas coestimuladoras. CD80 o CD86, sin los cuales los linfocitos sufren un estado de anergia.

Aunque el papel de la expresión de estas moléculas en las células neoplásicas sigue siendo muy controvertido, varios estudios han informado de una asociación positiva entre la expresión de HLA-DR y el resultado clínico en varios tipos de tumores: en el carcinoma de células escamosas de laringe, en el cáncer colorrectal , cáncer de estómago y otros. También en nuestro estudio "Expresión de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II-HLA-DR en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello" (ID 2222), los investigadores pudieron verificar que las células epiteliales neoplásicas del carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello adquieren la capacidad de expresar HLA-DR (datos no mostrados, en curso del trabajo científico que se presentará a la revista con factor de impacto y de la tesis doctoral final en Neurociencia de la estudiante de doctorado Chiara Prampolini). En algunos tipos de tumores, la expresión de HLA-DR se correlaciona con la presencia de células inmunes como las células mieloides de macrófagos CD16+/CD11c, asociadas con un buen pronóstico, y de células T que, recuperadas en el tejido dañado, determinan así la formación de un agente inmunogénico. microambiente que podría así apoyar una respuesta inmune antitumoral. Por tanto, la variabilidad en la expresión de las moléculas HLA-DR explicaría la diferente implicación inmune en el sitio del tumor y condicionaría la capacidad del huésped para frenar la progresión tumoral.

Un papel fundamental en la progresión tumoral es el microambiente, en el que cada vez se centran más estudios. El microambiente tumoral se caracteriza por diferentes poblaciones celulares, entre las cuales la población más abundante está representada por los fibroblastos asociados a tumores (CAF). Los CAF son fibroblastos que, en el contexto tumoral, asumen un fenotipo similar al de los miofibroblastos y se distinguen de los fibroblastos normales por una mayor expresión de α-sma, FAP y FSP-1, que representan sus marcadores específicos, así como una mayor expresión de vimentina, fibronectina y colágeno tipo XI. Numerosas evidencias en diferentes tipos de tumores han reportado tanto el papel inmunosupresor, ya que estas células son capaces in vitro de inhibir la proliferación de linfocitos T, favorecer su apoptosis o inducir el fenotipo de linfocitos T reguladores; y el papel protumoral, ya que son capaces de promover la proliferación e invasión tumoral, la angiogénesis y la metástasis, contribuyendo así al empeoramiento del pronóstico.

Muchos estudios centran su investigación en qué factores secretados por los CAF son responsables de su función. En particular, entre los numerosos factores secretados por los CAF, se encuentran las interleucinas IL-17 e IL-33 que, como se ha demostrado, pueden inducir la activación de moléculas HLA-DR en células mesenquimales derivadas de la médula ósea. Por tanto, parece interesante investigar el papel de HLA-DR en relación con la presencia del microambiente tumoral representado por los CAF. del estudio OBJETIVOS DEL ESTUDIO Objetivo principal del estudio

• Aislar cultivos de células epiteliales tumorales y de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) de muestras de tejido patológico y sano de pacientes con carcinoma primario de células escamosas de cabeza y cuello Objetivos secundarios del estudio
• Investigar la expresión de HLA-DR en los cultivos celulares obtenidos. Pacientes inscritos y métodos de inscripción Cálculo del tamaño de la muestra El cálculo del tamaño de la muestra se realizó mediante Análisis de Potencia, considerándose aceptable un error de primer tipo igual al 5% con una potencia de prueba del 90%, por lo tanto un error de segundo tipo del 10%. Para determinar el delta, la diferencia mínima aceptable a detectar entre los dos grupos comparados (grupo A: tejido sano; grupo B: tejido patológico) y la desviación estándar relativa a las poblaciones examinadas, se siguieron los cálculos del tamaño del efecto. directrices propuestas por Choen.

Pacientes Cuatro pacientes con carcinoma primario de células escamosas de cabeza y cuello ingresados ​​para tratamiento quirúrgico en la Clínica de Otorrinolaringología, Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Roma, en el año 2020-2021 se incluirán en el estudio.

De los 4 casos considerados estarán disponibles:

• Datos clinicos
• Consentimiento informado
• Muestra de tejido tumoral
• Muestra de tejido no tumoral tomada de material extirpado quirúrgicamente durante la cirugía

Consentimiento informado Se invitará a los sujetos involucrados en el estudio a leer la hoja de información del proyecto y a firmar personalmente el consentimiento informado para el uso de su material biológico y datos clínicos almacenados con fines de investigación.

Material orgánico De cada paciente incluido en el estudio se tomará una biopsia tanto del tejido patológico como del tejido sano extirpado durante la cirugía terapéutica, utilizado como control. Se cultivarán ambas biopsias.

5. Diseño del estudio El estudio es unicéntrico, sin ánimo de lucro, que consta de dos fases. La duración prevista del estudio es de 12 meses.

I FASE:

Selección de poblaciones celulares.

A través de medios de cultivo específicos se seleccionarán:

• Células epiteliales de biopsia sana y células epiteliales tumorales de biopsia de tumor mantenidas en cultivo con: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penicilina-estreptomicina 1%, L-glutamina 1%, insulina 10μg/ml, EGF 20ng /ml, hidrocortisona 0,5 µg/ml;
• Fibroblastos de biopsia sana y fibroblastos asociados a tumores (CAF) de biopsia de tumor mantenidos en cultivo con: DMEM High Glucose, FBS 10%, penicilina-estreptomicina 1%, L-glutamina 1%. Tanto los fibroblastos como los CAF se aislarán de cultivos de células epiteliales y tumorales, respectivamente, con una serie de pases en tripsina-EDTA al 0,25%.

Como control negativo se utilizarán poblaciones de células de la biopsia sana (células epiteliales sanas y fibroblastos).

FASE II: Evaluación de la expresión de HLA-DR en células epiteliales tumorales y CAF tumorales. La positividad de HLA-DR se evaluará mediante análisis de inmunofluorescencia doble con la adición de un marcador epitelial (citoqueratina), además de la evaluación de la presencia de moléculas coestimuladoras clásicas. (CD80, CD86).

Las células tumorales HLA-DR+ que no expresan las moléculas coestimuladoras serán estimuladas en cultivo con la administración de IFN-ɣ y LPS, con el fin de inducir su expresión.

Análisis estadístico Las comparaciones entre datos categóricos (tejido sano y patológico) se realizarán mediante prueba de chi-cuadrado o prueba exacta de Fisher, cuando corresponda. Todas las pruebas serán de dos colas y un alfa <0,05 se considerará estadísticamente significativo.