Исследование HLA-DR в культурах клеток, выделенных из первичного плоскоклеточного рака

Несколько исследований продемонстрировали корреляцию между экспрессией на опухолевых клетках молекул MHC II (главный комплекс гистосовместимости класса II), в частности молекул HLA-DR (человеческий лейкоцитарный антиген), и клиническим исходом заболевания. Действительно, было замечено, что опухолевые клетки при воспалительной стимуляции IFN-γ становятся способными экспрессировать молекулы MHC II, функционирующие как непрофессиональные APC (антигенпредставляющие клетки). Клетки APC отвечают за представление антигена Т-лимфоцитам, вызывая тем самым их активацию, что обязательно требует наличия двух сигналов: первый индуцируется молекулами MHC (MHC класс II для CD4+ лимфоцитов), а второй индуцируется костимулирующими молекулами. CD80 или CD86, без которых лимфоциты находятся в состоянии анергии.

Хотя роль экспрессии этих молекул на неопластических клетках до сих пор остается весьма спорной, о положительной связи между экспрессией HLA-DR и клиническим исходом сообщалось в нескольких исследованиях на различных типах опухолей: при плоскоклеточном раке гортани, колоректальном раке. , рак желудка и другие. Также в нашем исследовании «Экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости класса II-HLA-DR при плоскоклеточном раке головы и шеи» (ID 2222) исследователи смогли убедиться, что неопластические эпителиальные клетки плоскоклеточного рака голова и шея приобретают способность экспрессировать HLA-DR (данные не показаны, в ходе научной работы, которая будет представлена ​​в журнал с импакт-фактором, и финальной докторской диссертации по неврологии аспиранта Кьяры Прамполини). В некоторых типах опухолей экспрессия HLA-DR коррелирует с наличием иммунных клеток, таких как CD16+/CD11c-макрофаги миелоидных клеток, что связано с хорошим прогнозом, и Т-клеток, которые, вызываясь в поврежденной ткани, таким образом, определяют образование иммуногенного микроокружение, которое, таким образом, могло бы поддерживать противоопухолевый иммунный ответ. Следовательно, вариабельность экспрессии молекул HLA-DR могла бы объяснить различное иммунное участие в месте опухоли и обусловить способность хозяина остановить прогрессирование опухоли.

Фундаментальную роль в прогрессировании опухоли играет микроокружение, которому уделяется все больше внимания в исследованиях. Микроокружение опухоли характеризуется различными популяциями клеток, среди которых наиболее многочисленная популяция представлена ​​опухолеассоциированными фибробластами (ОФФ). CAF представляют собой фибробласты, которые в контексте опухоли принимают фенотип, аналогичный фенотипу миофибробластов, и отличаются от нормальных фибробластов большей экспрессией α-sma, FAP и FSP-1, которые представляют собой их специфические маркеры, а также большая экспрессия виментина, фибронектина и коллагена типа XI. Многочисленные данные о различных типах опухолей свидетельствуют как об иммуносупрессивной роли, поскольку эти клетки способны in vitro ингибировать пролиферацию Т-лимфоцитов, способствовать их апоптозу или индуцировать фенотип регуляторных Т-лимфоцитов; и проопухолевую роль, поскольку они способны способствовать пролиферации и инвазии опухоли, ангиогенезу и метастазированию, способствуя тем самым ухудшению прогноза.

Многие исследования направлены на то, какие факторы, секретируемые CAF, отвечают за их функцию. В частности, среди многих факторов, секретируемых CAF, есть интерлейкины IL-17 и IL-33, которые, как было показано, могут индуцировать активацию молекул HLA-DR на мезенхимальных клетках костномозгового происхождения. Поэтому кажется интересным изучить роль HLA-DR в отношении присутствия микроокружения опухоли, представленного CAF. ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ Основная цель исследования

• Изолировать культуры клеток опухолевого эпителия и рак-ассоциированных фибробластов (CAF) из образцов патологических и здоровых тканей пациентов с первичным плоскоклеточным раком головы и шеи. Вторичные цели исследования.
• Исследовать экспрессию HLA-DR в полученных культурах клеток. Зарегистрированные пациенты и методы регистрации. Расчет размера выборки. Расчет размера выборки проводился с использованием Power Analysis, считая допустимой ошибку первого рода, равную 5% при мощности теста 90%, следовательно, ошибку второго типа 10%. Для определения дельты, минимально приемлемой разницы, которую необходимо обнаружить между двумя сравниваемыми группами (группа А: здоровая ткань; группа Б: патологическая ткань) и стандартного отклонения, относящегося к исследуемым популяциям, были проведены расчеты величины эффекта. руководящие принципы, предложенные Чоном.

Пациенты В исследование будут включены четыре пациента с первичным плоскоклеточным раком головы и шеи, поступившие на хирургическое лечение в клинику отоларингологии Fondazione Policlinico Gemelli, IRCCS, Рим в 2020-2021 году.

Из 4-х рассмотренных кейсов будут доступны:

• Клинические данные
• Информированное согласие
• Образец опухолевой ткани
• Образец неопухолевой ткани, взятый из материала, хирургически удаленного во время операции.

Информированное согласие. Субъектам, участвующим в исследовании, будет предложено прочитать информационный листок проекта и лично подписать информированное согласие на использование сохраненного ими биологического материала и клинических данных в исследовательских целях.

Органический материал. У каждого пациента, включенного в исследование, будет взята биопсия как из патологической ткани, так и из здоровой ткани, удаленной во время терапевтической операции, используемой в качестве контроля. Обе биопсии будут культивированы.

5. Дизайн исследования. Исследование представляет собой некоммерческое одноцентровое исследование, состоящее из двух этапов. Ожидаемая продолжительность исследования составляет 12 месяцев.

I ЭТАП:

Отбор клеточных популяций

С помощью конкретных питательных сред будут выбраны:

• Эпителиальные клетки из здоровой биопсии и опухолевые эпителиальные клетки из биопсии опухоли, поддерживаемые в культуре с: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, пенициллин-стрептомицин 1%, L-глутамин 1%, инсулин 10 мкг/мл, EGF 20 нг /мл, гидрокортизон 0,5 мкг/мл;
• Фибробласты из здоровой биопсии и опухолеассоциированные фибробласты (CAF) из биопсии опухоли, поддерживаемые в культуре с: DMEM High Glucose, FBS 10%, пенициллин-стрептомицин 1%, L-глютамин 1%. И фибробласты, и CAF будут выделены из культур эпителиальных и опухолевых клеток, соответственно, с помощью серии пассажей в 0,25% трипсин-ЭДТА.

Популяции клеток здоровой биопсии (здоровые эпителиальные клетки и фибробласты) будут использоваться в качестве отрицательного контроля.

ФАЗА II: Оценка экспрессии HLA-DR в опухолевых эпителиальных клетках и опухолевых CAF. Положительность HLA-DR будет оцениваться с помощью двойного иммунофлуоресцентного анализа с добавлением эпителиального маркера (цитокератина) в дополнение к оценке присутствия классических костимулирующих молекул. (CD80, CD86).

Опухолевые клетки HLA-DR+, которые не экспрессируют костимулирующие молекулы, будут стимулироваться в культуре введением IFN-α и ЛПС, чтобы индуцировать их экспрессию.

Статистический анализ. Сравнение категориальных данных (здоровой и патологической ткани) будет проводиться с помощью критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера, где это необходимо. Все тесты будут двусторонними, и альфа <0,05 будет считаться статистически значимым.