HLA-DR:n tutkimus primaarisesta levyepiteelikarsinoomasta eristettyissä soluviljelmissä

Useat tutkimukset ovat osoittaneet korrelaation MHC II:n (major histocompatibility complex class II) molekyylien, erityisesti HLA-DR (ihmisen leukosyyttiantigeeni) molekyylien, ilmentymisen ja taudin kliinisen lopputuloksen välillä. On todellakin havaittu, että IFN-y:n tulehduksellisen stimulaation alaisista kasvainsoluista tulee kykeneviä ekspressoimaan MHC II -molekyylejä, jotka toimivat ei-ammattimaisina APC:inä (antigeenia esittelevät solut). APC-solut ovat vastuussa antigeenin esittelemisestä T-lymfosyyteille, mikä indusoi niiden aktivaation, mikä edellyttää välttämättä kahden signaalin läsnäoloa: ensimmäinen MHC-molekyylien indusoima signaali (MHC-luokka II CD4+-lymfosyyteille) ja toinen kostimuloivien molekyylien indusoima signaali. CD80 tai CD86, jota ilman lymfosyytit joutuvat anergiatilaan.

Vaikka näiden molekyylien ilmentymisen rooli neoplastisissa soluissa on edelleen erittäin kiistanalainen, positiivinen yhteys HLA-DR:n ilmentymisen ja kliinisen lopputuloksen välillä on raportoitu useissa erityyppisillä kasvaimilla tehdyissä tutkimuksissa: kurkunpään okasolusyövässä, paksusuolensyövässä. , mahasyöpä ja muut. Myös tutkimuksessamme "Pään ja kaulan levyepiteelisyövän pään ja kaulan levyepiteelisyövän molekyylien ilmentyminen" (ID 2222) tutkijat pystyivät varmistamaan, että neoplastiset epiteelisolut pää ja kaula saavuttavat kyvyn ekspressoida HLA-DR:tä (tietoja ei ole esitetty, tieteellisessä työssä, joka on esitettävä julkaisussa vaikuttavuustekijällä, ja tohtoriopiskelija Chiara Prampolinin neurotieteiden lopullinen väitöskirja). Joissakin kasvaintyypeissä HLA-DR:n ilmentyminen korreloi immuunisolujen, kuten CD16+/CD11c-makrofagimyeloidisolujen läsnäolon kanssa, jotka liittyvät hyvään ennusteeseen, ja T-soluihin, jotka vaurioituneesta kudoksesta palautuvat, määräävät siten immunogeenisen solun muodostumisen. mikroympäristö, joka voisi näin tukea kasvainten vastaista immuunivastetta. Siksi vaihtelevuus HLA-DR-molekyylien ilmentymisessä selittäisi erilaisen immuunivasteen kasvainkohdassa ja ehdolla isännän kykyä pysäyttää kasvaimen eteneminen.

Keskeinen rooli kasvaimen etenemisessä on mikroympäristö, johon yhä useammat tutkimukset keskittyvät. Kasvainmikroympäristölle on ominaista erilaiset solupopulaatiot, joista runsainta populaatiota edustavat kasvaimeen liittyvät fibroblastit (CAF). CAF:t ovat fibroblasteja, jotka omaksuvat kasvaimen yhteydessä samanlaisen fenotyypin kuin myofibroblastit ja jotka voidaan erottaa normaaleista fibroblasteista niiden spesifisiä markkereita edustavien α-sma:n, FAP:n ja FSP-1:n suuremman ilmentymisen ansiosta. vimentiinin, fibronektiinin ja tyypin XI kollageenin suurempi ilmentyminen. Lukuisat todisteet erityyppisistä kasvaimista ovat raportoineet sekä immunosuppressiivisesta roolista, koska nämä solut kykenevät in vitro estämään T-lymfosyyttien proliferaatiota, edistämään niiden apoptoosia tai indusoimaan säätelevien T-lymfosyyttien fenotyyppiä; ja tuumoria edistävä rooli, koska ne pystyvät edistämään kasvaimen proliferaatiota ja invaasiota, angiogeneesiä ja metastasoitumista, mikä myötävaikuttaa ennusteen huononemiseen.

Monet tutkimukset suuntaavat tutkimustaan ​​siihen, mitkä CAF:ien erittämät tekijät ovat vastuussa niiden toiminnasta. Erityisesti monien CAF:ien erittämien tekijöiden joukossa ovat interleukiinit IL-17 ja IL-33, jotka, kuten on osoitettu, voivat indusoida HLA-DR-molekyylien aktivaation luuytimestä peräisin olevissa mesenkymaalisissa soluissa. Siksi näyttää mielenkiintoiselta tutkia HLA-DR:n roolia suhteessa CAF:ien edustaman kasvaimen mikroympäristön esiintymiseen. tutkimuksesta TUTKIMUKSEN TAVOITTEET Tutkimuksen ensisijainen tavoite

• Kasvaimen epiteeli- ja syöpään liittyvien fibroblastien (CAF) soluviljelmien eristäminen patologisista ja terveistä kudosnäytteistä potilailta, joilla on primaarinen pään ja kaulan okasolusyöpä. Tutkimuksen toissijaiset tavoitteet
• HLA-DR:n ilmentymisen tutkiminen saaduissa soluviljelmissä. Ilmoittautuneet potilaat ja ilmoittautumismenetelmät Otoskoon laskeminen Otoskoon laskeminen suoritettiin Power Analysis -ohjelmalla, jolloin hyväksyttiin ensimmäisen tyypin virhe, joka on 5 % ja testiteho 90 %, joten toisen tyypin virhe 10 %. Deltan, kahden verrattavan ryhmän välillä havaittavan pienimmän hyväksyttävän eron (ryhmä A: terve kudos; ryhmä B: patologinen kudos) ja tutkittaviin populaatioihin liittyvän keskihajonnan määrittämiseksi noudatettiin vaikutuksen koon laskelmia. Choenin ehdottamat ohjeet.

Potilaat Tutkimukseen otetaan mukaan neljä pään ja kaulan primaarista okasolusyöpää sairastavaa potilasta, jotka on otettu leikkaukseen Otolaryngology Clinicin Fondazione Policlinico Gemellissä, IRCCS, Rooma, vuosina 2020-2021.

Neljästä harkitusta tapauksesta on saatavilla:

• Kliiniset tiedot
• Tietoinen suostumus
• Kasvainkudosnäyte
• Ei-kasvainkudosnäyte, joka on otettu leikkauksen aikana kirurgisesti poistetusta materiaalista

Tietoinen suostumus Tutkimukseen osallistuvia koehenkilöitä pyydetään lukemaan hankkeen tietolomake ja allekirjoittamaan henkilökohtaisesti tietoinen suostumus tallennetun biologisen materiaalin ja kliinisen tiedon käyttämiseen tutkimustarkoituksiin.

Orgaaninen materiaali Jokaiselta tutkimukseen osallistuvalta potilaalta otetaan biopsia sekä patologisesta kudoksesta että terapeuttisen leikkauksen aikana poistetusta terveestä kudoksesta, jota käytetään kontrollina. Molemmat biopsiat viljellään.

5. Tutkimuksen suunnittelu Tutkimus on voittoa tavoittelematon, yksikeskus, joka koostuu kahdesta vaiheesta. Tutkimuksen arvioitu kesto on 12 kuukautta.

I VAIHE:

Solupopulaatioiden valinta

Tietyn viljelyalustan kautta valitaan:

• Epiteelisolut terveestä biopsiasta ja kasvaimen epiteelisolut kasvainbiopsiasta, joita ylläpidettiin viljelmässä: DMEM High Glucose + HAM'S F12 1:1, FBS 10%, penisilliini-streptomysiini 1%, L-glutamiini 1%, insuliini 10 µg /ml, EGF 20 ng /ml, hydrokortisoni 0,5 ug/ml;
• Fibroblastit terveestä biopsiasta ja kasvaimeen liittyvät fibroblastit (CAF) kasvainbiopsiasta, joita ylläpidettiin viljelmässä: DMEM High Glucose, FBS 10%, penisilliini-streptomysiini 1%, L-glutamiini 1%. Sekä fibroblastit että CAF:t eristetään epiteelisolu- ja kasvainsoluviljelmistä, vastaavasti, siirrostussarjalla trypsiini-EDTA:ssa 0,25 %.

Solupopulaatioita terveestä biopsiasta (terveet epiteelisolut ja fibroblastit) käytetään negatiivisena kontrollina.

VAIHE II: HLA-DR:n ilmentymisen arviointi kasvaimen epiteelisoluissa ja kasvaimen CAF:issä HLA-DR-positiivisuus arvioidaan kaksois-immunofluoresenssianalyysillä, johon on lisätty epiteelimarkkeri (sytokeratiini) klassisten kostimuloivien molekyylien läsnäolon arvioinnin lisäksi. (CD80, CD86).

HLA-DR+ kasvainsoluja, jotka eivät ilmennä kostimulatorisia molekyylejä, stimuloidaan viljelmässä antamalla IFN-ɣ:a ja LPS:ää niiden ilmentymisen indusoimiseksi.

Tilastollinen analyysi Kategoristen tietojen (terve ja patologinen kudos) vertailut tehdään khin neliötestillä tai Fisherin eksaktitestillä tarvittaessa. Kaikki testit ovat kaksisuuntaisia ​​ja alfa <0,05 katsotaan tilastollisesti merkitseväksi.