ポリフェノール摂取後の血漿誘発性メタボローム変化

参加者 12 人の健康な参加者 (男性 9 人、女性 3 人) がこの研究のために募集されました。平均±SDの年齢、身長、体重、BMIはそれぞれ29±7歳、174.8±9.3cm、77.29±10.52kg、25.23±1.87kg/m2であった。 健康スクリーニングアンケートによって評価され、書面によるインフォームドコンセントが提供されたことから、すべての参加者は健康でした。 この研究の除外基準は次のとおりであった：食物アレルギー（研究チームと協議したとおり）、胃腸疾患、腎臓疾患、心血管疾患、甲状腺疾患の既往歴、および食品サプリメントの現在の使用。 この研究はノーサンブリア大学倫理委員会から倫理的承認を得ました（参照番号：39904）（臨床試験未定）。

実験計画 この研究では、低用量（LOW）、高用量（ HI) の TC またはプラセボ (CON)。 各フェーズの間には少なくとも 7 日間 (ただし 21 日を超えない) の休薬期間が実施されました。 参加者は、日内変動を考慮して、10 時間の一晩絶食した後、午前 7 時 45 分に研究の各フェーズの開始に参加する必要がありました (図 1)。 研究室に到着すると、参加者は安静状態（少なくとも 5 分間座った後）でベースライン血圧 (BP) を記録し、その後連続採血のためにカニューレを挿入しました。 その後、標準化された朝食が提供されました。 次いで、ベースライン、ＶＴＣ摂取後１、２、３、５および８時間後にその後の測定を行った。 水は自由に与えられましたが、検査訪問中は追加の食物は与えられませんでした。

治療と食事管理 低用量（LOW）および高用量（HI）は、それぞれ 3 または 6 g の TC サプリメント（CherryCraft）、またはマルトデキストリンを使用してカロリー量を調整した 3 g のカプセルプラセボ（CON）で構成されていました。 低 TC 用量では、約 60 ～ 78 mg のアントシアニン、8.07 kcal が提供され、炭水化物、脂肪、タンパク質の主要栄養素含有量はそれぞれ 1.215 g、0.003 g、0.042 g でした。 高用量の TC では、約 120 ～ 156 mg のアントシアニン、16.14 kcal、炭水化物、脂肪、タンパク質がそれぞれ 2.43 g、0.006 g、0.08 g 提供されました。

参加者は、試験期間中、習慣的な食事に従うことが求められました。 食事日記は各検査訪問前の 24 時間に記入され、次の検査訪問でも検査前に（できるだけ近いうちに）再現されました。 標準化された朝食は、白いトースト (セインズベリーの中型白パン 2 枚) とバター (約 2 枚) で構成されていました。 ベルトーリ/バイタライト 16g (カロリーと主要栄養素の含有量が可能な限り一致するビーガン代替品))。 参加者には試験訪問中ずっと水を自由に飲ませ、ベースラインから、朝食とサプリメント摂取の1、2、3、5、8時間後に測定して補充した。

血圧モニタリング 血圧は、検査訪問中、研究室到着直後、およびサプリメント摂取後 1、2、3、5、および 8 時間後にモニタリングされました (Keane, George, et al., 2016)。

血液サンプリング手順 静脈血サンプル (約 10 mL) を、研究室到着直後と、サプリメント摂取後 1、2、3、5、および 8 時間後に肘前窩からリチウム ヘパリン (10 mL) チューブに採取しました。 サンプルを直ちに 4℃ で 20 分間遠心分離（3000 × g）し、血漿を吸引してピペットで約 1 mL に分注し、後の分析のためにすぐに -80 ℃ で保存しました。

非標的血漿分析 サンプルはまず氷上で解凍し、次に血漿 200 μL を抽出し、分析グレードのメタノール 1000 μL とボルテックスして、水氷浴中で 15 分間超音波処理することによって調製しました。 次にサンプルを 15,000 rpm、4℃で 15 分間遠心分離し、その後上清を真空前濃縮器で 3 時間乾燥させました。 残渣を分析グレードの水 100 μL で再構成し（30 秒間ボルテックスし、15 分間超音波処理）、その後 0.22 ミクロンの Costar スピンフィルターで濾過し、200 μL マイクロインサートを備えた 1.5 mL オートサンプラーバイアルに入れました。

代謝物の特性評価は、LCMS (IDX 高分解能質量分析計システムに接続された Vanquish 液体クロマトグラフィー フロントエンド、Thermo Scientific、Hemel Hempstead、英国) で実行されました。 MS データは、AcquieX 取得ワークフロー (データ依存分析) を使用して取得されました。 MS 動作パラメータは次のとおりです: MS1 質量分解能 60K、MS2 30K ステップ エネルギー (HCD) 20、25、50 スキャン範囲 100 ～ 1000、RF レンズ (%) 35、AGC ゲイン、強度しきい値 2e4 25% カスタム注入モード射出時間は 54 ミリ秒です。 抽出ブランクを使用してバックグラウンド除外リストを作成し、プールされた QC を使用して包含リストを作成しました。 C18 RP、クロマトグラフィー分離は、Waters Acquity UPLC T3 HSS カラム (2.1 x 150mm、粒子サイズ 1.7 μm) を使用し、45℃、流速 200 μL/min で操作してアーカイブされました。 LC グラジエントは、二成分緩衝液系、緩衝液 A (LC/MS グレードの水/ACN 95/5 v/v) および緩衝液 B (LC/MS グレード ACN/水 95/5 v/v) で構成されます。 独立したバッファー システムをポジティブ モードとネガティブ モードの取得に使用し、バッファーの pH は両方に 0.1% ギ酸を使用して調整しました。 LC 勾配は両方の極性で同じで、T0 で 5% B を 1.5 分間保持し、11 分で 95% B まで直線的に減少して 4 分間保持し、開始条件に戻ってさらに 4.5 分間保持しました (カラムの安定化)。 ポジティブモードに印加した電圧は3.5 kV、注入量は3 μLでした。 ２００μＬのＨＥＳＩ条件は以下の通りであった：シースガス：３５、補助ガス７、スイープガス０。イオン移送管温度は３００℃、気化器温度は２７５℃であった。

データ分析 統計分析は、ＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．、イリノイ州シカゴ）を使用して実施した。 記述統計量は平均値 ± SD として報告されます。 血圧は、治療（低用量対高用量対プラセボ）を使用して、時間別（ベースライン、サプリメント摂取後1、2、3、5および8時間）反復測定分散分析（RMANOVA）を使用して分析されました。 Mauchly の球形性検定は、すべての変数の分散の均一性をチェックするために使用されました。必要に応じて、グリーンハウス・ガイザー調整を使用して仮定の違反を修正しました。 重要な相互作用効果は、事後分析を使用して追跡調査されました。 統計的有意性のアルファ レベルは 0.05 に設定されました。