Plazma által kiváltott változások az anyagcserében polifenol fogyasztást követően

Résztvevők Tizenkét egészséges résztvevőt (kilenc férfit és három nőt) vettek fel ebbe a vizsgálatba; az átlagos ± SD életkor, termet, tömeg és testtömeg-index (BMI) 29 ± 7 év, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg és 25,23 ± 1,87 kg/m2 volt. Az egészségügyi szűrő kérdőív alapján minden résztvevő egészséges volt, és írásos, tájékozott beleegyezését adta. A vizsgálat kizárási kritériumai a következők voltak: ételallergia (a kutatócsoporttal megbeszéltek szerint), gyomor-bélrendszeri, vese-, szív- és érrendszeri vagy pajzsmirigy-betegség a kórtörténetben és bármilyen táplálékkiegészítő jelenlegi használata. Ez a tanulmány megkapta a Northumbria Egyetem Etikai Bizottságának etikai jóváhagyását (hivatkozási szám: 39904) (klinikai vizsgálat megerősítve).

Kísérleti tervezés A tanulmány kettős vak, három karból álló keresztezett, pszeudo-randomizált (ellentétesen kiegyensúlyozott a sorrendi hatások kiküszöbölése érdekében) tervezést alkalmazott annak érdekében, hogy azonosítsa a metabolomikus eltolódásokat kis dózisú (LOW), nagy dózisú ( HI) TC vagy placebo (CON). Az egyes fázisok között legalább 7 napos (de legfeljebb 21 napos) kimosási időszakot alkalmaztak. A résztvevőknek 10 órás éjszakai koplalás után reggel 7:45-kor kellett részt venniük a vizsgálat minden fázisának kezdetén, hogy figyelembe vegyék a napi eltéréseket (1. ábra). A laborba érkezéskor a résztvevők kiindulási vérnyomását (BP) nyugalmi állapotban (legalább 5 perces ülés után) rögzítették, majd sorozatos vérmintavétel céljából kanülbe helyezték. Ezután szabványos reggelit biztosítottak. A következő intézkedéseket az alapvonalon, 1, 2, 3, 5 és 8 órával a VTC fogyasztása után végeztük. Vizet ad-libitum biztosítottak, de a vizsgálati látogatások során nem adtak további táplálékot.

Kezelések és étrend-ellenőrzés Az alacsony (ALACSONY) és magas (HI) dózis 3 vagy 6 g TC-kiegészítőből (CherryCraft), vagy 3 g kapszula placebóból (CON) állt, amelyet maltodextrint alkalmazó kalóriatartalommal párosítottak. Az alacsony TC-dózis hozzávetőlegesen 60-78 mg antocianint, 8,07 kcal-t biztosított, és makrotápanyag-tartalma 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g szénhidrát, zsír és fehérje esetében. A magas TC-dózis körülbelül 120-156 mg antocianint, 16,14 kcal-t, 2,43 g-ot, 0,006 g-ot, 0,08 g-ot szénhidrátból, zsírból és fehérjéből 0,08 g-ot biztosított.

A résztvevőket arra kérték, hogy tartsák be szokásos étrendjüket a vizsgálat során. Az étkezési naplókat minden egyes vizsgálati látogatás előtt 24 órával töltöttük, hogy megismételjük (amennyire közel) a következő vizsgálati látogatásokon történő tesztelés előtt. A szabványos reggeli fehér pirítósból (2 szelet Sainsbury's közepes fehér kenyérből) és vajból (kb. 16 g Bertolli/Vitalite (vegán alternatíva, a lehető legpontosabb kalória- és makrotápanyag-tartalommal)). A résztvevők ad-libitum vizet kaptak, hogy ihassanak a vizsgálati látogatások során, ezt megmérték és újratöltötték az alapvonaltól, valamint 1, 2, 3, 5 és 8 órával a reggeli és a táplálékkiegészítő bevétele után.

Vérnyomás-ellenőrzés A vérnyomást a vizsgálati látogatások során, közvetlenül a laboratóriumba érkezéskor, valamint 1, 2, 3, 5 és 8 órával a kiegészítő bevétele után monitorozták (Keane, George és mtsai, 2016).

Vérmintavételi eljárás Vénás vérmintákat (~10 ml) vettünk az antecubitalis üregből lítium-heparin (10 ml) csövekbe, közvetlenül a laborba érkezéskor és 1, 2, 3, 5 és 8 órával a kiegészítő bevétele után. A mintákat azonnal centrifugáltuk (3000 x g) 4 °C-on 20 percig, majd a plazmát leszívtuk és ~1 ml-es alikvot részekre pipettáztuk, majd azonnal -80 °C-on tároltuk későbbi elemzés céljából.

Nem célzott plazma analízis A mintát először jégen felolvasztva készítettük el, majd 200 µl plazmát extraháltunk, és 1000 µl analitikai tisztaságú metanollal vortexeltük, majd vizes jégfürdőben 15 percig ultrahanggal kezeltük. A mintákat ezután 15 percig centrifugáltuk 15 000 fordulat/perc sebességgel 4 °C-on, majd a felülúszót vákuum-előkoncentrátorban 3 órán át szárazra szárítottuk. A maradékot 100 µl analitikai tisztaságú vízben oldottuk fel (vortex 30 másodpercig és ultrahanggal kezeltük 15 percig), majd 0,22 mikronos Costar spinszűrőn átszűrtük, és 1,5 ml-es automatikus mintavevő fiolába helyeztük, 200 µl-es mikrobetéttel.

A metabolitok jellemzését LCMS-en (Vanquish Liquid chromatography Front end connect to IDX High Resolution Mass Spectrometer system, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Egyesült Királyság) végeztük. Az MS adatokat az AcquieX adatgyűjtési munkafolyamat (adatfüggő elemzés) segítségével szereztük be. Az MS működési paraméterei a következők voltak: MS1 tömegfelbontás 60K, MS2-nél 30K lépcsőzetes energia (HCD) 20,25,50 pásztázási tartomány 100-1000, RF len (%) 35, AGC erősítés, intenzitásküszöb 2e4 25% egyéni befecskendezési mód 54 ms befecskendezési idővel. Kivonatolási üres lapot használtunk a háttérkizárási lista létrehozásához, és egy összevont minőségellenőrzést használtunk a felvételi lista létrehozásához. C18 RP, a kromatográfiás elválasztást Waters Acquity UPLC T3 HSS oszlopon (2,1 x 150 mm, 1,7 μm részecskemérettel) archiválták, 45 °C-on, 200 μl/perc áramlási sebességgel. Az LC gradiens bináris pufferrendszerből, A pufferből (LC/MS minőségű víz/ACN 95/5 v/v) és B pufferből (LC/MS minőségű ACN/víz 95/5 v/v) áll. A pozitív és negatív módusok felvételére független pufferrendszert használtunk, a pufferek pH-ját mindkettőnél 0,1%-os hangyasavval állítottuk be. Az LC gradiens mindkét polaritásnál azonos volt, 5% B T0-nál tartsa 1,5 percig, és lineárisan csökken 95%B-ra 11 percnél, tartsa 4 percig, majd térjen vissza a kiindulási állapotba, és tartsa további 4,5 percig (oszlop stabilizálása). A pozitív üzemmódhoz alkalmazott feszültség 3,5 kV, a befecskendezési térfogat 3 μL volt. A HESI állapota a következő volt 200 μl-re: köpenygáz: 35, segédgáz 7 és seprőgáz 0. Az iontranszfer cső hőmérséklete 300°C, a párologtató hőmérséklete 275°C volt.

Adatelemzés A statisztikai elemzést SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL.) segítségével végeztük. A leíró statisztikákat átlag ± SD formában jelentik. A BP-t egy kezelés (alacsony vs. nagy dózis vs. placebo) alkalmazásával elemeztük idő szerint (kiindulási érték, 1, 2, 3, 5 és 8 órával a kiegészítés után), ismételt mérési varianciaanalízissel (RMANOVA). A Mauchly-féle szférikussági tesztet használtuk a variancia homogenitásának ellenőrzésére minden változó esetében; ahol szükséges volt, a feltételezés megsértését a Greenhouse-Geisser korrekcióval korrigálták. A jelentős interakciós hatásokat post hoc elemzéssel követték nyomon. A statisztikai szignifikancia alfa-szintjét 0,05-ben állítottuk be.