Plasmainduzierte Veränderungen im Metabolom nach Polyphenolkonsum

Teilnehmer Für diese Studie wurden zwölf gesunde Teilnehmer (neun Männer und drei Frauen) rekrutiert; Das mittlere ± SD-Alter, die Statur, die Masse und der Body-Mass-Index (BMI) betrugen 29 ± 7 Jahre, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg bzw. 25,23 ± 1,87 kg/m2. Alle Teilnehmer waren laut einem Fragebogen zum Gesundheitsscreening gesund und gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Ausschlusskriterien für die Studie waren wie folgt: Nahrungsmittelallergie (wie mit dem Forschungsteam besprochen), Vorgeschichte von Magen-Darm-, Nieren-, Herz-Kreislauf- oder Schilddrüsenerkrankungen und aktuelle Verwendung von Nahrungsergänzungsmitteln. Diese Studie erhielt die ethische Genehmigung der Ethikkommission der Northumbria University (Referenznummer: 39904) (klinische Studie wird noch bestätigt).

Experimentelles Design Die Studie nutzte ein doppelblindes, dreiarmiges, pseudo-randomisiertes Crossover-Design (ausgewogen, um Ordnungseffekte zu eliminieren), um metabolische Verschiebungen nach der akuten Einnahme einer niedrigen Dosis (LOW) oder einer hohen Dosis ( HI) von TC oder Placebo (CON). Zwischen den einzelnen Phasen wurde eine Auswaschphase von mindestens 7 Tagen (aber nicht mehr als 21 Tagen) eingeführt. Die Teilnehmer mussten nach einem 10-stündigen Fasten über Nacht zu Beginn jeder Phase der Studie um 7:45 Uhr anwesend sein, um tageszeitliche Schwankungen zu berücksichtigen (Abbildung 1). Bei der Ankunft im Labor wurde der Ausgangsblutdruck (BP) der Teilnehmer im Ruhezustand (nach mindestens 5 Minuten Sitzen) aufgezeichnet und dann mit einer Kanüle für die serielle Blutentnahme versehen. Anschließend wurde ein standardisiertes Frühstück bereitgestellt. Nachfolgende Messungen wurden dann zu Beginn, 1, 2, 3, 5 und 8 Stunden nach dem VTC-Verbrauch, durchgeführt. Wasser wurde nach Belieben bereitgestellt, während der Testbesuche wurde jedoch kein zusätzliches Futter verabreicht.

Behandlungen und Ernährungskontrolle Die niedrige (LOW) und hohe (HI) Dosis bestand aus 3 bzw. 6 g des TC-Ergänzungsmittels (CherryCraft) oder einem 3-g-Kapsel-Placebo (CON), abgestimmt auf den Kaloriengehalt unter Verwendung von Maltodextrin. Die niedrige TC-Dosis lieferte etwa 60–78 mg Anthocyane, 8,07 kcal, und hatte einen Makronährstoffgehalt von 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g, jeweils für Kohlenhydrate, Fett und Protein. Die hohe TC-Dosis lieferte ungefähr 120–156 mg Anthocyane, 16,14 kcal mit 2,43 g, 0,006 g bzw. 0,08 g für Kohlenhydrate, Fett und Protein.

Die Teilnehmer wurden gebeten, während des gesamten Versuchs ihre gewohnte Ernährung einzuhalten. Für die 24 Stunden vor jedem Testbesuch wurden Ernährungstagebücher erstellt, um die Ergebnisse vor dem Test bei folgenden Testbesuchen (so nah wie möglich) zu reproduzieren. Das standardisierte Frühstück bestand aus weißem Toast (2 Scheiben mittelgroßes Weißbrot von Sainsbury) und Butter (ca. 16g Bertolli/Vitalite (eine vegane Alternative, möglichst genau aufeinander abgestimmt in Kalorien und Makronährstoffgehalt)). Den Teilnehmern wurde während der Testbesuche nach Belieben Wasser zum Trinken gegeben, dies wurde gemessen und ab dem Ausgangswert sowie 1, 2, 3, 5 und 8 Stunden nach dem Frühstück und der Einnahme von Nahrungsergänzungsmitteln nachgefüllt.

Blutdrucküberwachung Der Blutdruck wurde während der Testbesuche unmittelbar nach der Ankunft im Labor und 1, 2, 3, 5 und 8 Stunden nach der Einnahme des Nahrungsergänzungsmittels überwacht (Keane, George et al., 2016).

Verfahren zur Blutentnahme Venöse Blutproben (ca. 10 ml) wurden aus der Fossa antecubitalis in Lithium-Heparin-Röhrchen (10 ml) gesammelt, unmittelbar nach der Ankunft im Labor und 1, 2, 3, 5 und 8 Stunden nach der Einnahme des Nahrungsergänzungsmittels. Die Proben wurden sofort 20 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert (3000 × g), das Plasma wurde dann abgesaugt und in Aliquots von ca. 1 ml pipettiert und dann sofort zur späteren Analyse bei –80 °C gelagert.

Ungezielte Plasmaanalyse Die Probe wurde vorbereitet, indem sie zunächst auf Eis aufgetaut wurde, dann 200 µl Plasma extrahiert und mit 1000 µl analytischem Methanol verwirbelt und dann 15 Minuten lang in einem Wassereisbad beschallt wurden. Die Proben wurden dann 15 Minuten lang bei 15.000 U/min bei 4 °C zentrifugiert, bevor der Überstand in einem Vakuum-Vorkonzentrator 3 Stunden lang zur Trockne getrocknet wurde. Der Rückstand wurde in 100 µL analytischem Wasser rekonstituiert (30 Sekunden lang vortexen und 15 Minuten lang beschallt), bevor er über einen 0,22-Mikron-Costar-Spinfilter filtriert und in ein 1,5-ml-Autosamplerfläschchen mit einem 200 µL-Mikroeinsatz gegeben wurde.

Metabolitencharakterisierungen wurden auf einem LCMS (Vanquish Liquid Chromatography Front End verbunden mit dem IDX High Resolution Mass Spectrometer System, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Vereinigtes Königreich) durchgeführt. Die MS-Daten wurden mit dem AcquieX-Erfassungsworkflow (datenabhängige Analyse) erfasst. Die MS-Betriebsparameter waren wie folgt: MS1-Massenauflösung 60 K, für MS2 30 K Stufenenergie (HCD) 20,25,50 Scanbereich 100–1000, RF-Lenke (%) 35, AGC-Verstärkung, Intensitätsschwelle 2e4 25 % benutzerdefinierter Injektionsmodus mit einer Einspritzzeit von 54 ms. Zur Erstellung einer Hintergrund-Ausschlussliste wurde ein Extraktionsrohling verwendet, und zur Erstellung der Einschlussliste wurde eine gepoolte QC verwendet. C18 RP, die chromatographische Trennung wurde unter Verwendung einer Waters Acquity UPLC T3 HSS-Säule (2,1 x 150 mm mit einer Partikelgröße von 1,7 μm) archiviert, die bei 45 °C mit einer Flussrate von 200 μl/min betrieben wurde. Der LC-Gradient besteht aus einem binären Puffersystem, Puffer A (Wasser in LC/MS-Qualität/ACN 95/5 v/v) und Puffer B (ACN in LC/MS-Qualität/Wasser 95/5 v/v). Für die Erfassung im Positiv- und Negativmodus wurde ein unabhängiges Puffersystem verwendet. Der pH-Wert der Puffer wurde für beide mit 0,1 % Ameisensäure eingestellt. Der LC-Gradient war für beide Polaritäten derselbe, 5 % B bei T0, 1,5 Minuten halten und linear auf 95 % B bei 11 Minuten abfallen, 4 Minuten halten und zum Ausgangszustand zurückkehren und weitere 4,5 Minuten halten (Säulenstabilisierung). Die im positiven Modus angelegte Spannung betrug 3,5 kV und das Injektionsvolumen betrug 3 μL. Die HESI-Bedingungen waren für 200 μl wie folgt: Hüllgas: 35, Hilfsgas 7 und Spülgas 0. Die Temperatur des Ionentransferrohrs betrug 300 °C und die Verdampfertemperatur 275 °C.

Datenanalyse Die statistische Analyse wurde mit SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL) durchgeführt. Beschreibende Statistiken werden als Mittelwert ± SD angegeben. Der Blutdruck wurde unter Verwendung einer Behandlung (niedrige vs. hohe Dosis vs. Placebo) anhand einer Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (RMANOVA) analysiert. Der Sphärizitätstest von Mauchly wurde verwendet, um die Homogenität der Varianz für alle Variablen zu überprüfen. Sofern erforderlich, wurden etwaige Verstöße gegen die Annahme mithilfe der Greenhouse-Geisser-Anpassung korrigiert. Signifikante Interaktionseffekte wurden mittels Post-hoc-Analyse weiterverfolgt. Der Alpha-Wert für die statistische Signifikanz wurde auf 0,05 festgelegt.