Cambiamenti indotti dal plasma nel metaboloma in seguito al consumo di polifenoli

Partecipanti Per questo studio sono stati reclutati dodici partecipanti sani (nove maschi e tre femmine); la media ± SD di età, statura, massa e indice di massa corporea (BMI) era rispettivamente di 29 ± 7 anni, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg e 25,23 ± 1,87 kg/m2. Tutti i partecipanti erano sani, come valutato da un questionario di screening sanitario e hanno fornito il consenso informato scritto. I criteri di esclusione per lo studio erano i seguenti: allergia alimentare (come discusso con il gruppo di ricerca), storia di malattie gastrointestinali, renali, cardiovascolari o tiroidee e uso attuale di eventuali integratori alimentari. Questo studio ha ricevuto l'approvazione etica dal Comitato Etico della Northumbria University (numero di riferimento: 39904) (studio clinico da confermare).

Disegno sperimentale Lo studio ha utilizzato un disegno in doppio cieco, a tre bracci incrociati, pseudo-randomizzato (controbilanciato per eliminare gli effetti dell'ordine) al fine di identificare cambiamenti metabolomici a seguito dell'ingestione acuta di una dose bassa (BASSA), una dose alta ( HI) di TC o placebo (CON). È stato implementato un periodo di washout di almeno 7 giorni (ma non superiore a 21 giorni) tra ciascuna fase. I partecipanti dovevano presentarsi all'inizio di ciascuna fase dello studio alle 7:45 dopo un digiuno notturno di 10 ore per tenere conto della variazione diurna (Figura 1). All'arrivo in laboratorio, la pressione sanguigna basale (BP) dei partecipanti è stata registrata in uno stato di riposo (dopo almeno 5 minuti di seduta), quindi incannulata per il prelievo di sangue seriale. È stata quindi fornita una colazione standardizzata. Successivamente sono state adottate misure al basale, 1, 2, 3, 5 e 8 ore dopo il consumo di VTC. L'acqua veniva fornita ad libitum, ma non veniva somministrato cibo aggiuntivo durante le visite di test.

Trattamenti e controllo dietetico La dose bassa (LOW) e alta (HI) consisteva rispettivamente in 3 o 6 g dell'integratore TC (CherryCraft) o in una capsula da 3 g di placebo (CON) abbinata per contenuto calorico utilizzando maltodestrina. La dose bassa di TC forniva circa 60-78 mg di antociani, 8,07 kcal e aveva un contenuto di macronutrienti di 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g, rispettivamente per carboidrati, grassi e proteine. La dose elevata di TC ha fornito circa 120-156 mg di antociani, 16,14 kcal con 2,43 g, 0,006 g, 0,08 g rispettivamente di carboidrati, grassi e proteine.

Ai partecipanti è stato chiesto di seguire la loro dieta abituale durante lo studio. Sono stati compilati diari alimentari per le 24 ore precedenti ciascuna visita di test per replicarli (il più vicino possibile) prima del test nelle visite di test successive. La colazione standard consisteva in pane tostato bianco (2 fette di pane bianco medio Sainsbury's) e burro (ca. 16 g di Bertolli/Vitalite (un'alternativa vegana, il più simile possibile per calorie e contenuto di macronutrienti)). Ai partecipanti è stata data acqua da bere ad libitum durante le visite di test, questa è stata misurata e riempita dal basale e 1, 2, 3, 5 e 8 ore dopo la colazione e l'assunzione di integratori.

Monitoraggio della pressione arteriosa La pressione arteriosa è stata monitorata durante le visite di test, immediatamente all'arrivo in laboratorio e 1, 2, 3, 5 e 8 ore dopo l'ingestione dell'integratore (Keane, George, et al., 2016).

Procedura di campionamento del sangue I campioni di sangue venoso (~10 ml) sono stati raccolti dalla fossa antecubitale in provette di eparina di litio (10 ml), immediatamente all'arrivo in laboratorio e 1, 2, 3, 5 e 8 ore dopo l'ingestione del supplemento. I campioni sono stati immediatamente centrifugati (3000 × g) a 4°C per 20 minuti, il plasma è stato quindi aspirato e pipettato in aliquote da ~1 ml e quindi immediatamente conservato a -80°C per l'analisi successiva.

Analisi del plasma non mirato Il campione è stato preparato scongelandolo prima su ghiaccio, quindi 200 µl di plasma sono stati estratti e vortexati con 1000 µl di metanolo di grado analitico, quindi sonicato in un bagno di acqua e ghiaccio per 15 minuti. I campioni sono stati poi centrifugati per 15 minuti a 15.000 giri al minuto a 4°C, prima che il surnatante fosse essiccato in un preconcentratore sotto vuoto a secchezza per 3 ore. Il residuo è stato ricostituito in 100 µl di acqua di grado analitico (vortexare per 30 secondi e sonicato per 15 minuti), prima di essere filtrato tramite filtro spin Costar da 0,22 micron e inserito in una fiala per autocampionatore da 1,5 ml con un microinserto da 200 µl.

Le caratterizzazioni dei metaboliti sono state eseguite su un LCMS (front-end della cromatografia liquida Vanquish collegato al sistema di spettrometro di massa ad alta risoluzione IDX, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Regno Unito). I dati MS sono stati acquisiti utilizzando il flusso di lavoro di acquisizione AcquieX (analisi dipendente dai dati). I parametri operativi MS erano i seguenti: risoluzione di massa MS1 60K, per MS2 30K energia a gradini (HCD) 20,25,50 intervallo di scansione 100-1000, lente RF (%) 35, guadagno AGC, soglia di intensità 2e4 25% modalità di iniezione personalizzata con un tempo di iniezione di 54 ms. È stato utilizzato uno spazio vuoto di estrazione per creare un elenco di esclusione dello sfondo e un QC in pool è stato utilizzato per creare l'elenco di inclusione. C18 RP, la separazione cromatografica è stata archiviata utilizzando una colonna Waters Acquity UPLC T3 HSS (2,1 x 150 mm con dimensione delle particelle di 1,7 μm), operante a 45°C con una portata di 200 μL/min. Il gradiente LC è costituito da un sistema tampone binario, tampone A (acqua di grado LC/MS/ACN 95/5 v/v) e tampone B (acqua di grado LC/MS ACN/acqua 95/5 v/v). Per l'acquisizione in modalità positiva e negativa è stato utilizzato un sistema di tamponi indipendenti, il pH dei tamponi è stato regolato utilizzando acido formico allo 0,1% per entrambi. Il gradiente LC era lo stesso per entrambe le polarità, 5% B al mantenimento T0 per 1,5 minuti e diminuzione lineare al 95% B al mantenimento di 11 minuti per 4 minuti e ritorno alla condizione iniziale e mantenimento per ulteriori 4,5 minuti (stabilizzazione della colonna). La tensione applicata per la modalità positiva era di 3,5 kV e il volume di iniezione era di 3 μL. Le condizioni HESI erano le seguenti per 200 μL: gas guaina: 35, gas ausiliario 7 e gas di scansione pari a 0. La temperatura del tubo di trasferimento ionico era di 300°C e la temperatura del vaporizzatore era di 275°C.

Analisi dei dati L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Le statistiche descrittive sono riportate come media ± DS. La pressione arteriosa è stata analizzata utilizzando un trattamento (dose bassa vs. dose alta vs. placebo) mediante analisi della varianza con misure ripetute nel tempo (baseline, 1, 2, 3, 5 e 8 ore dopo l'integrazione) (RMANOVA). Il test della sfericità di Mauchly è stato utilizzato per verificare l'omogeneità della varianza per tutte le variabili; ove necessario, eventuali violazioni del presupposto sono state corrette utilizzando il Greenhouse-Geisser adjustment. Gli effetti di interazione significativi sono stati seguiti utilizzando l'analisi post hoc. Il livello alfa per la significatività statistica è stato fissato a 0,05.