Plasma-induserte endringer i metabolomet etter polyfenolforbruk

Deltakere Tolv friske deltakere (ni menn og tre kvinner) ble rekruttert til denne studien; gjennomsnittlig ± SD alder, vekst, masse og kroppsmasseindeks (BMI) var henholdsvis 29 ± 7 år, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg og 25,23 ± 1,87 kg/m2. Alle deltakerne var friske, vurdert ved et spørreskjema for helsescreening og gitt skriftlig, informert samtykke. Eksklusjonskriterier for studien var som følger: matallergi (som diskutert med forskerteamet), historie med gastrointestinal, nyre-, kardiovaskulær eller skjoldbruskkjertelsykdom og nåværende bruk av eventuelle kosttilskudd. Denne studien fikk etisk godkjenning fra Northumbria University Ethics Committee (referansenummer: 39904) (klinisk utprøving tbc).

Eksperimentell design Studien brukte en dobbeltblind, tre-arms cross-over, pseudo-randomisert (motbalansert for å eliminere ordreeffekter) design for å identifisere metabolomiske endringer etter akutt inntak av en lav dose (LOW), høy dose ( HI) av TC eller placebo (CON). En utvaskingsperiode på minst 7 dager (men ikke mer enn 21 dager) mellom hver fase ble implementert. Deltakerne ble pålagt å delta på starten av hver fase av studien kl. 7:45 etter en 10 timers faste over natten for å ta høyde for variasjon i døgnet (figur 1). Ved ankomst til laboratoriet ble deltakernes baseline-blodtrykk (BP) registrert i uthvilt tilstand (etter minst 5 minutter sittende), deretter kanylert for seriell blodprøvetaking. En standardisert frokost ble deretter levert. Påfølgende tiltak ble deretter tatt ved baseline, 1, 2, 3, 5 og 8 timer etter VTC-forbruk. Vann ble gitt ad libitum, men ingen ekstra mat ble gitt under testbesøk.

Behandlinger og kostholdskontroll Den lave (LAV) og høye (HI) dosen besto av henholdsvis 3 eller 6 g av TC-tilskuddet (CherryCraft), eller en 3 g kapsel-placebo (CON) matchet for kaloriinnhold ved bruk av maltodekstrin. Den lave TC-dosen ga omtrent 60-78 mg antocyaniner, 8,07 kcal og hadde et makronæringsinnhold på 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g, for henholdsvis karbohydrater, fett og protein. Den høye TC-dosen ga omtrent 120-156 mg antocyaniner, 16,14 kcal med 2,43 g, 0,006 g, 0,08 g for henholdsvis karbohydrater, fett og protein.

Deltakerne ble bedt om å følge sitt vanlige kosthold gjennom hele forsøket. Matdagbøker ble fullført i 24 timer før hvert testbesøk for å replikere (så nærme) før testing på følgende testbesøk. Den standardiserte frokosten besto av hvit toast (2 skiver Sainsburys middels hvite brød) og smør (ca. 16g Bertolli/Vitalite (et vegansk alternativ, matchet så godt som mulig for kalorier og makronæringsstoffinnhold)). Deltakerne fikk vann å drikke ad libitum gjennom testbesøkene, dette ble målt og fylt på fra baseline, og 1, 2, 3, 5 og 8 timer etter frokost og inntak av kosttilskudd.

Blodtrykksovervåking Blodtrykket ble overvåket gjennom testbesøkene, umiddelbart etter ankomst til laboratoriet og 1, 2, 3, 5 og 8 timer etter inntak av kosttilskuddet (Keane, George, et al., 2016).

Blodprøveprosedyre Venøse blodprøver (~10 mL) ble samlet fra antecubital fossa i litiumheparin (10 mL) rør, umiddelbart etter ankomst til laboratoriet og 1, 2, 3, 5 og 8 timer etter inntak av tilskuddet. Prøver ble umiddelbart sentrifugert (3000 × g) ved 4 °C i 20 minutter, plasma ble deretter aspirert og pipettert i ~1 ml alikvoter og deretter umiddelbart lagret ved -80 °C for senere analyse.

Ikke-målrettet plasmaanalyse Prøven ble fremstilt ved først å tines på is, deretter ble 200 µL plasma ekstrahert og vortexet med 1000 µL metanol av analytisk kvalitet, deretter sonikert i et vannisbad i 15 minutter. Prøvene ble deretter sentrifugert i 15 minutter ved 15 000 rpm ved 4°C, før supernatanten ble tørket i en vakuumforkonsentrator til tørrhet i 3 timer. Resten ble rekonstituert i 100 µL vann av analytisk kvalitet (virvel i 30 s og sonikert i 15 minutter), før den ble filtrert via 0,22 mikron Costar-spinnfilter og satt i 1,5 ml autosampler-ampulle med en 200 µL mikroinnsats.

Metabolittkarakteriseringer ble utført på en LCMS (Vanquish Liquid chromatography Front end koblet til IDX High Resolution Mass Spectrometer system, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Storbritannia). MS-dataene ble innhentet ved hjelp av AcquieX-innhentingsarbeidsflyten (dataavhengig analyse). MS driftsparametere var som følger: MS1 masseoppløsning 60K, for MS2 30K trinnenergi (HCD) 20,25,50 skanneområde 100-1000, RF len (%) 35, AGC forsterkning, intensitetsterskel 2e4 25 % tilpasset injeksjonsmodus med en injeksjonstid på 54 ms. En ekstraksjonsblank ble brukt til å lage en eksklusjonsliste i bakgrunnen og en samlet QC ble brukt til å lage inkluderingslisten. C18 RP, den kromatografiske separasjonen ble arkivert ved bruk av en Waters Acquity UPLC T3 HSS-kolonne (2,1 x 150 mm med partikkelstørrelse på 1,7 μm), som opererer ved 45 ° C med en strømningshastighet på 200 μL/min. LC-gradienten består av binært buffersystem, buffer A (LC/MS grade vann/ACN 95/5 v/v) og Buffer B (LC/MS grade ACN/Water 95/5 v/v). Uavhengig buffersystem ble brukt for positiv og negativ moduserverv, pH til buffere ble justert ved å bruke 0,1 % maursyre for begge. LC-gradienten var den samme for begge polaritetene, 5 % B ved T0 holde i 1,5 min og lineær reduksjon til 95 % B ved 11 min hold i 4 minutter og gå tilbake til starttilstand og hold i ytterligere 4,5 min (søylestabilisering). Spenningen påført for positiv modus var 3,5 kV og injeksjonsvolumet var 3 μL. HESI-tilstanden var som følger for 200 μL: kappegass: 35, hjelpegass 7 og sveipegass på 0. Ioneoverføringsrørets temperatur var 300°C og fordampertemperaturen var 275°C.

Dataanalyse Statistisk analyse ble utført ved bruk av SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Beskrivende statistikk rapporteres som gjennomsnitt ± SD. BP ble analysert ved å bruke en behandling (lav vs. høy dose vs. placebo) etter tid (grunnlinje, 1, 2, 3, 5 og 8 timer etter tilskudd) gjentatte mål variansanalyse (RMANOVA). Mauchlys test av sfærisitet ble brukt for å sjekke varianshomogenitet for alle variabler; der det var nødvendig, ble eventuelle brudd på forutsetningen korrigert ved hjelp av Greenhouse-Geisser-justeringen. Signifikante interaksjonseffekter ble fulgt opp ved hjelp av post hoc analyse. Alfanivået for statistisk signifikans ble satt til 0,05.