Plasma-inducerade förändringar i metabolomen efter polyfenolkonsumtion

Deltagare Tolv friska deltagare (nio män och tre kvinnor) rekryterades till denna studie; medelvärdet ± SD-ålder, resning, massa och body mass index (BMI) var 29 ± 7 år gamla, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg respektive 25,23 ± 1,87 kg/m2. Alla deltagare var friska, vilket bedömdes med ett frågeformulär för hälsoscreening och gav skriftligt informerat samtycke. Exklusionskriterier för studien var följande: födoämnesallergi (som diskuterats med forskargruppen), historia av gastrointestinala, njur-, kardiovaskulära eller sköldkörtelsjukdomar och nuvarande användning av eventuella kosttillskott. Denna studie fick etiskt godkännande från Northumbria University Ethics Committee (referensnummer: 39904) (klinisk prövning tbc).

Experimentell design Studien använde en dubbelblind, trearmad crossover, pseudo-randomiserad (motbalanserad för att eliminera ordningseffekter) design för att identifiera metabolomiska förändringar efter akut intag av en låg dos (LOW), hög dos ( HI) av TC eller placebo (CON). En tvättperiod på minst 7 dagar (men inte mer än 21 dagar) mellan varje fas implementerades. Deltagarna var tvungna att närvara vid starten av varje fas av studien kl. 7:45 efter en 10 timmars fasta över natten för att ta hänsyn till dygnsvariation (Figur 1). Vid ankomsten till labbet registrerades deltagarnas baslinjeblodtryck (BP) i vilat tillstånd (efter minst 5 minuters sittande), sedan kanylerades för seriell blodprovtagning. En standardiserad frukost tillhandahölls sedan. Efterföljande åtgärder vidtogs sedan vid baslinjen, 1, 2, 3, 5 och 8 timmar efter VTC-konsumtion. Vatten tillfördes ad libitum, men ingen ytterligare mat gavs under testbesöken.

Behandlingar och kostkontroll Den låga (LÅG) och den höga (HI) dosen bestod av 3 eller 6 g av TC-tillskottet (CherryCraft), eller en 3 g kapselplacebo (CON) matchad för kaloriinnehåll med maltodextrin. Den låga TC-dosen gav cirka 60-78 mg antocyaniner, 8,07 kcal och hade en makronäringshalt på 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g, för kolhydrater, fett respektive protein. Den höga TC-dosen gav cirka 120-156 mg antocyaniner, 16,14 kcal med 2,43 g, 0,006 g, 0,08 g för kolhydrater, fett respektive protein.

Deltagarna ombads följa sin vanliga diet under hela försöket. Matdagböcker fylldes i under de 24 timmarna före varje testbesök för att replikera (så nära) innan testning vid efterföljande testbesök. Den standardiserade frukosten bestod av vitt rostat bröd (2 skivor Sainsburys medium vitt bröd) och smör (ca. 16g Bertolli/Vitalite (ett veganskt alternativ, matchat så nära som möjligt för kalorier och makronäringsinnehåll)). Deltagarna fick vatten att dricka ad libitum under testbesöken, detta mättes och fylldes på från baslinjen och 1, 2, 3, 5 och 8 timmar efter frukost och intag av kosttillskott.

Blodtrycksövervakning Blodtrycket övervakades under hela testbesöken, omedelbart efter ankomsten till labbet och 1, 2, 3, 5 och 8 timmar efter intag av tillägget (Keane, George, et al., 2016).

Blodprovsprocedur Venösa blodprover (~10 mL) samlades från den antecubital fossa i litiumheparin (10 mL) rör, omedelbart efter ankomst till labbet och 1, 2, 3, 5 och 8 timmar efter intag av tillägget. Prover centrifugerades omedelbart (3000 × g) vid 4°C i 20 minuter, plasma aspirerades sedan och pipetterades i ~1 ml alikvoter och lagrades sedan omedelbart vid -80°C för senare analys.

Oriktad plasmaanalys Provet bereddes genom att först tinas på is, sedan extraherades 200 µL plasma och virvlades med 1000 µL metanol av analytisk kvalitet, och sonikerades sedan i ett vattenisbad i 15 minuter. Proverna centrifugerades sedan i 15 minuter vid 15 000 rpm vid 4°C, innan supernatanten torkades i en vakuumförkoncentrator till torrhet under 3 timmar. Återstoden rekonstituerades i 100 µL vatten av analytisk kvalitet (virvel i 30 s och sonikerades i 15 minuter), innan den filtrerades via 0,22 mikron Costar-spinfilter och placerades i 1,5 ml autosamplerflaska med en 200 µL mikroinsats.

Metabolitkarakteriseringar utfördes på en LCMS (Vanquish Liquid chromatography Front end ansluten till IDX High Resolution Mass Spectrometer system, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Storbritannien). MS-data förvärvades med hjälp av AcquieX-förvärvningsarbetsflödet (databeroende analys). MS driftsparametrar var följande: MS1 massupplösning 60K, för MS2 30K stegenergi (HCD) 20,25,50 skanningsområde 100-1000, RF len (%) 35, AGC-förstärkning, intensitetströskel 2e4 25% anpassat injektionsläge med en injektionstid på 54 ms. En extraktionsblank användes för att skapa en bakgrundsexklusionslista och en poolad QC användes för att skapa inkluderingslistan. C18 RP, den kromatografiska separationen arkiverades med hjälp av en Waters Acquity UPLC T3 HSS-kolonn (2,1 x 150 mm med partikelstorlek 1,7 μm), arbetande vid 45 ° C med en flödeshastighet på 200 μL/min. LC-gradienten består av binärt buffertsystem, buffert A (LC/MS kvalitet vatten/ACN 95/5 v/v) och buffert B (LC/MS kvalitet ACN/Vatten 95/5 v/v). Oberoende buffertsystem användes för positiv och negativ modförvärvning, pH för buffertar justerades med användning av 0,1 % myrsyra för båda. LC-gradienten var densamma för båda polariteterna, 5 % B vid T0 hålls i 1,5 min och minskar linjärt till 95 % B vid 11 min håll i 4 min och återgår till starttillståndet och hålls i ytterligare 4,5 min (kolonnstabilisering). Spänningen som applicerades för positivt läge var 3,5 kV och injektionsvolymen var 3 μL. HESI-tillståndet var följande för 200 μL: mantelgas: 35, hjälpgas 7 och svepgas på 0. Jonöverföringsrörets temperatur var 300°C och förångarens temperatur var 275°C.

Dataanalys Statistisk analys utfördes med användning av SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Beskrivande statistik rapporteras som medelvärde ± SD. BP analyserades med användning av en behandling (låg vs. hög dos vs. placebo) genom tid (baslinje, 1, 2, 3, 5 och 8 timmar efter tillägg) upprepade mätningar av variansanalys (RMANOVA). Mauchlys test av sfäricitet användes för att kontrollera variansens homogenitet för alla variabler; vid behov korrigerades eventuella överträdelser av antagandet med Greenhouse-Geisser-justeringen. Signifikanta interaktionseffekter följdes upp med post hoc-analys. Alfanivån för statistisk signifikans sattes till 0,05.