Plazmou indukované změny v metabolomu po konzumaci polyfenolů

Účastníci Do této studie bylo vybráno dvanáct zdravých účastníků (devět mužů a tři ženy); průměr ± SD věk, postava, hmotnost a index tělesné hmotnosti (BMI) byly 29 ± 7 let, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg a 25,23 ± 1,87 kg/m2, v tomto pořadí. Všichni účastníci byli zdraví, jak bylo hodnoceno dotazníkem zdravotního screeningu a poskytli písemný informovaný souhlas. Kritéria vyloučení ze studie byla následující: potravinová alergie (jak bylo diskutováno s výzkumným týmem), anamnéza gastrointestinálního, renálního, kardiovaskulárního nebo štítného onemocnění a současné užívání jakýchkoli potravinových doplňků. Tato studie získala etické schválení Etickou komisí univerzity Northumbria (referenční číslo: 39904) (klinická studie bude k dispozici).

Experimentální design Studie využívala dvojitě zaslepený, tříramenný zkřížený, pseudo-randomizovaný (vyvážený, aby se eliminovaly účinky pořadí) za účelem identifikace metabolomických posunů po akutním požití nízké dávky (LOW), vysoké dávky ( HI) TC nebo placeba (CON). Mezi každou fází byla zavedena vymývací perioda alespoň 7 dní (ale ne delší než 21 dní). Účastníci byli požádáni, aby se zúčastnili začátku každé fáze studie v 7:45 ráno po 10hodinovém nočním hladovění, aby se zohlednily denní odchylky (obrázek 1). Po příjezdu do laboratoře byl účastníkům zaznamenáván základní krevní tlak (BP) v klidovém stavu (po alespoň 5 minutách sezení) a poté kanylován pro sériový odběr krve. Poté byla poskytnuta standardizovaná snídaně. Následná měření pak byla provedena na začátku, 1, 2, 3, 5 a 8 hodin po spotřebě VTC. Voda byla podávána ad-libitum, ale během testovacích návštěv nebyla podávána žádná další potrava.

Léčba a dietní kontrola Nízká (NÍZKÁ) a vysoká (HI) dávka sestávala ze 3 nebo 6 g doplňku TC (CherryCraft), v daném pořadí, nebo 3g tobolky placeba (CON) odpovídající kalorickému obsahu pomocí maltodextrinu. Nízká dávka TC poskytla přibližně 60-78 mg anthokyanů, 8,07 kcal a měla obsah makroživin 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g pro sacharidy, tuky a bílkoviny. Vysoká dávka TC poskytla přibližně 120-156 mg anthokyanů, 16,14 kcal s 2,43 g, 0,006 g, 0,08 g pro sacharidy, tuky a bílkoviny.

Účastníci byli požádáni, aby během studie dodržovali svou obvyklou stravu. Potravinové deníky byly vyplněny po dobu 24 hodin před každou testovací návštěvou, aby se replikovaly (co nejblíže) před testováním na následujících testovacích návštěvách. Standardizovaná snídaně se skládala z bílého toastu (2 plátky středně bílého chleba Sainsbury's) a másla (cca. 16 g Bertolli/Vitalite (veganská alternativa, co nejpřesněji sladěné z hlediska kalorií a obsahu makroživin)). Účastníkům byla podávána voda k pití ad-libitum během testovacích návštěv, tato byla měřena a doplňována od výchozí hodnoty a 1, 2, 3, 5 a 8 hodin po snídani a požití doplňku.

Monitorování krevního tlaku Krevní tlak byl monitorován během testovacích návštěv, ihned po příjezdu do laboratoře a 1, 2, 3, 5 a 8 hodin po požití doplňku (Keane, George, et al., 2016).

Postup odběru vzorků krve Vzorky žilní krve (~10 ml) byly odebrány z předloktní jamky do zkumavek s lithiovým heparinem (10 ml) ihned po příjezdu do laboratoře a 1, 2, 3, 5 a 8 hodin po požití doplňku. Vzorky byly okamžitě centrifugovány (3000 x g) při 4 °C po dobu 20 minut, plazma byla poté odsáta a pipetována do ~1 ml alikvotů a poté okamžitě uložena při -80 °C pro pozdější analýzu.

Analýza necílené plazmy Vzorek byl připraven nejprve rozmražením na ledu, poté bylo extrahováno 200 ul plazmy a vortexováno s 1000 ul methanolu analytické čistoty a poté sonikováno v lázni s ledem po dobu 15 minut. Vzorky byly poté odstřeďovány po dobu 15 minut při 15 000 otáčkách za minutu při 4 °C, poté byl supernatant sušen ve vakuovém předkoncentrátoru do sucha po dobu 3 hodin. Zbytek byl rekonstituován ve 100 ul vody analytické čistoty (vířivý po dobu 30 s a sonikován po dobu 15 minut), předtím, než byl filtrován přes 0,22 mikronový odstředivý filtr Costar a vložen do 1,5 ml lahvičky autosampleru s 200 ul mikrovložkou.

Charakterizace metabolitů byly provedeny na LCMS (Vanquish Liquid chromatografie Front end připojený k IDX High Resolution Mass Spectrometer system, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Spojené království). MS data byla získána pomocí AcquieX akviziční workflow (analýza závislá na datech). Provozní parametry MS byly následující: MS1 hmotnostní rozlišení 60K, pro MS2 30K stupňová energie (HCD) 20,25,50 rozsah skenování 100-1000, RF čočka (%) 35, zisk AGC, práh intenzity 2e4 25% vlastní režim vstřikování s dobou vstřiku 54 ms. K vytvoření seznamu vyloučení na pozadí bylo použito prázdné místo pro extrakci a k ​​vytvoření seznamu zahrnutí byla použita sdružená kontrola kvality. C18 RP, chromatografická separace byla archivována pomocí Waters Acquity UPLC T3 HSS kolony (2,1 x 150 mm s velikostí částic 1,7 μm), pracující při 45 °C s průtokem 200 ul/min. LC gradient se skládá z binárního pufrového systému, pufru A (LC/MS kvalita voda/ACN 95/5 obj./obj.) a pufru B (LC/MS kvalita ACN/voda 95/5 obj./obj.). Nezávislý systém pufrů byl použit pro akvizici pozitivního a negativního módu, pH pufrů bylo upraveno pomocí 0,1% kyseliny mravenčí pro oba. Gradient LC byl stejný pro obě polarity, 5 % B při TO podržte po dobu 1,5 minuty a lineárně se snížil na 95 % B po dobu 11 minut podržte po dobu 4 minut a vraťte se do výchozích podmínek a podržte po dobu dalších 4,5 minut (stabilizace sloupce). Napětí aplikované pro pozitivní mód bylo 3,5 kV a injekční objem byl 3 μl. Podmínky HESI pro 200 ul byly následující: plášťový plyn: 35, pomocný plyn 7 a omítací plyn 0. Teplota iontové přenosové trubice byla 300 °C a teplota odpařovače byla 275 °C.

Analýza dat Statistická analýza byla provedena pomocí SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Popisné statistiky jsou uváděny jako průměr ± SD. BP byl analyzován pomocí léčby (nízká vs. vysoká dávka vs. placebo) podle času (základní hodnota, 1, 2, 3, 5 a 8 hodin po doplnění) analýzy rozptylu opakovaných měření (RMANOVA). Ke kontrole homogenity rozptylu pro všechny proměnné byl použit Mauchlyho test sféricity; v případě potřeby byla všechna porušení předpokladu opravena pomocí skleníkové-Geisserovy úpravy. Významné interakční účinky byly sledovány pomocí post hoc analýzy. Hladina alfa pro statistickou významnost byla stanovena na 0,05.