Alterações induzidas por plasma no metaboloma após consumo de polifenol

Participantes Doze participantes saudáveis ​​(nove homens e três mulheres) foram recrutados para este estudo; as médias ± DP de idade, estatura, massa e índice de massa corporal (IMC) foram 29 ± 7 anos, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg e 25,23 ± 1,87 kg/m2, respectivamente. Todos os participantes eram saudáveis, conforme avaliado por um questionário de triagem de saúde e forneceram consentimento informado por escrito. Os critérios de exclusão do estudo foram os seguintes: alergia alimentar (conforme discutido com a equipe de pesquisa), histórico de doenças gastrointestinais, renais, cardiovasculares ou da tireoide e uso atual de qualquer suplementação alimentar. Este estudo recebeu aprovação ética do Comitê de Ética da Universidade de Northumbria (número de referência: 39904) (ensaio clínico a confirmar).

Desenho Experimental O estudo utilizou um desenho duplo-cego, cruzado de três braços, pseudo-randomizado (contrabalançado para eliminar efeitos de ordem) para identificar alterações metabolômicas após a ingestão aguda de uma dose baixa (BAIXA), dose alta ( HI) de TC ou placebo (CON). Foi implementado um período de eliminação de pelo menos 7 dias (mas não superior a 21 dias) entre cada fase. Os participantes foram obrigados a comparecer ao início de cada fase do estudo às 7h45, após um jejum noturno de 10 horas, a fim de levar em conta a variação diurna (Figura 1). Ao chegar ao laboratório, a pressão arterial (PA) basal dos participantes foi registrada em estado de repouso (após pelo menos 5 minutos sentados) e, em seguida, canulada para coletas de sangue em série. Um café da manhã padronizado foi então fornecido. As medidas subsequentes foram então tomadas no início do estudo, 1, 2, 3, 5 e 8 horas após o consumo de VTC. A água foi fornecida ad libitum, mas nenhum alimento adicional foi fornecido durante as visitas de teste.

Tratamentos e controle dietético A dose baixa (BAIXA) e alta (HI) consistiu em 3 ou 6 g do suplemento TC (CherryCraft), respectivamente, ou uma cápsula placebo de 3g (CON) correspondente ao conteúdo calórico usando maltodextrina. A dose baixa de CT forneceu aproximadamente 60-78 mg de antocianinas, 8,07 kcal e teve teor de macronutrientes de 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g, para carboidratos, gordura e proteína, respectivamente. A dose elevada de CT forneceu aproximadamente 120-156 mg de antocianinas, 16,14 kcal com 2,43 g, 0,006 g, 0,08 g de carboidratos, gordura e proteína, respectivamente.

Os participantes foram solicitados a seguir sua dieta habitual durante todo o estudo. Os diários alimentares foram preenchidos 24 horas antes de cada visita de teste para replicar (o mais próximo possível) antes do teste nas visitas de teste seguintes. O café da manhã padronizado consistia em torradas brancas (2 fatias de pão branco médio Sainsbury's) e manteiga (aprox. 16g de Bertolli/Vitalite (uma alternativa vegana, com a melhor correspondência possível em termos de calorias e conteúdo de macronutrientes)). Os participantes receberam água para beber ad libitum durante as visitas de teste, esta foi medida e reabastecida a partir do início do estudo e 1, 2, 3, 5 e 8 horas após o café da manhã e a ingestão do suplemento.

Monitoramento da pressão arterial A pressão arterial foi monitorada durante as visitas de teste, imediatamente após a chegada ao laboratório e 1, 2, 3, 5 e 8 horas após a ingestão do suplemento (Keane, George, et al., 2016).

Procedimento de coleta de sangue Amostras de sangue venoso (~10 mL) foram coletadas da fossa antecubital em tubos de heparina de lítio (10 mL), imediatamente após a chegada ao laboratório e 1, 2, 3, 5 e 8 horas após a ingestão do suplemento. As amostras foram imediatamente centrifugadas (3000 × g) a 4°C por 20 min, o plasma foi então aspirado e pipetado em alíquotas de ~1 mL e imediatamente armazenado a -80°C para análise posterior.

Análise de plasma não direcionado A amostra foi preparada primeiro sendo descongelada em gelo, depois 200 µL de plasma foram extraídos e agitados em vórtice com 1000 µL de metanol de grau analítico, depois sonicados em banho de água gelada por 15 minutos. As amostras foram então centrifugadas durante 15 min a 15.000 rpm a 4°C, antes do sobrenadante ser seco num pré-concentrador a vácuo até à secura durante 3 h. O resíduo foi reconstituído em 100 µL de água de grau analítico (vortex por 30 s e sonicado por 15 minutos), antes de ser filtrado através de filtro de rotação Costar de 0,22 mícron e colocado em frasco de amostrador automático de 1,5 mL com um microinserto de 200 µL.

As caracterizações dos metabólitos foram realizadas em um LCMS (front-end de cromatografia líquida Vanquish conectado ao sistema de espectrômetro de massa de alta resolução IDX, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Reino Unido). Os dados MS foram adquiridos usando o fluxo de trabalho de aquisição AcquieX (análise dependente de dados). Os parâmetros operacionais do MS foram os seguintes: resolução de massa MS1 60K, para MS2 30K energia escalonada (HCD) 20,25,50 faixa de varredura 100-1000, lente RF (%) 35, ganho AGC, limite de intensidade 2e4 modo de injeção personalizado de 25% com um tempo de injeção de 54 ms. Um espaço em branco de extração foi usado para criar uma lista de exclusão de fundo e um CQ agrupado foi usado para criar a lista de inclusão. C18 RP, a separação cromatográfica foi arquivada utilizando uma coluna Waters Acquity UPLC T3 HSS (2,1 x 150mm com tamanho de partícula de 1,7 μm), operando a 45°C com vazão de 200 μL/min. O gradiente LC consiste em sistema tampão binário, tampão A (água de grau LC/MS/ACN 95/5 v/v) e tampão B (ACN/água de grau LC/MS 95/5 v/v). Sistema de tampões independentes foi utilizado para aquisição de modo positivo e negativo, o pH dos tampões foi ajustado usando ácido fórmico a 0,1% para ambos. O gradiente de LC foi o mesmo para ambas as polaridades, 5% B em T0 mantido por 1,5 min e diminuindo linearmente para 95% B em 11 min mantido por 4 minutos e retornando à condição inicial e mantido por mais 4,5 min (estabilização da coluna). A tensão aplicada para o modo positivo foi de 3,5 kV e o volume de injeção foi de 3 μL. As condições HESI foram as seguintes para 200 μL: gás de bainha: 35, gás auxiliar 7 e gás de varredura de 0. A temperatura do tubo de transferência de íons foi de 300°C e a temperatura do vaporizador foi de 275°C.

Análise de dados A análise estatística foi realizada utilizando SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL.). As estatísticas descritivas são relatadas como média ± DP. A PA foi analisada usando um tratamento (dose baixa vs. dose alta vs. placebo) por tempo (linha de base, 1, 2, 3, 5 e 8 horas pós-suplemento) análise de variância de medidas repetidas (RMANOVA). O teste de esfericidade de Mauchly foi utilizado para verificar a homogeneidade da variância para todas as variáveis; sempre que necessário, quaisquer violações do pressuposto foram corrigidas utilizando o ajustamento Greenhouse-Geisser. Efeitos de interação significativos foram acompanhados usando análise post hoc. O nível alfa para significância estatística foi fixado em 0,05.