Plasma-inducerede ændringer i metabolomet efter polyphenolforbrug

Deltagere Tolv raske deltagere (ni mænd og tre kvinder) blev rekrutteret til denne undersøgelse; den gennemsnitlige ± SD alder, statur, masse og kropsmasseindeks (BMI) var henholdsvis 29 ± 7 år gamle, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg og 25,23 ± 1,87 kg/m2. Alle deltagere var raske, vurderet ved hjælp af et sundhedsscreeningsspørgeskema og gav skriftligt informeret samtykke. Eksklusionskriterier for undersøgelsen var som følger: fødevareallergi (som diskuteret med forskerholdet), historie med mave-tarm-, nyre-, kardiovaskulær eller skjoldbruskkirtelsygdom og nuværende brug af kosttilskud. Denne undersøgelse modtog etisk godkendelse fra Northumbria University Ethics Committee (referencenummer: 39904) (klinisk forsøg tbc).

Eksperimentelt design Undersøgelsen benyttede et dobbeltblindt, tre-arms cross-over, pseudo-randomiseret (modbalanceret for at eliminere ordreeffekter) design for at identificere metabolomiske skift efter akut indtagelse af en lav dosis (LOW), høj dosis ( HI) af TC eller placebo (CON). En udvaskningsperiode på mindst 7 dage (men ikke mere end 21 dage) mellem hver fase blev implementeret. Deltagerne var forpligtet til at deltage i starten af ​​hver fase af undersøgelsen kl. 7:45 efter en 10 timers faste natten over for at tage højde for daglig variation (figur 1). Ved ankomsten til laboratoriet blev deltagernes baseline-blodtryk (BP) registreret i en udhvilet tilstand (efter at have siddet i mindst 5 minutter), derefter kanyleret til seriel blodprøvetagning. En standardiseret morgenmad blev derefter leveret. Efterfølgende foranstaltninger blev derefter taget ved baseline, 1, 2, 3, 5 og 8 timer efter VTC-forbrug. Vand blev givet ad libitum, men der blev ikke givet yderligere mad under testbesøg.

Behandlinger og kostkontrol Den lave (LAV) og høje (HI) dosis bestod af henholdsvis 3 eller 6 g af TC-supplementet (CherryCraft), eller en 3 g kapsel placebo (CON) matchet for kalorieindhold ved hjælp af maltodextrin. Den lave TC-dosis gav cirka 60-78 mg anthocyaniner, 8,07 kcal og havde et makronæringsstofindhold på 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g, for henholdsvis kulhydrater, fedt og protein. Den høje TC-dosis gav ca. 120-156 mg anthocyaniner, 16,14 kcal med henholdsvis 2,43 g, 0,006 g, 0,08 g for kulhydrater, fedt og protein.

Deltagerne blev bedt om at følge deres sædvanlige kost under hele forsøget. Fødevaredagbøger blev afsluttet i de 24 timer før hvert testbesøg for at replikere (så tæt på) før testning på efterfølgende testbesøg. Den standardiserede morgenmad bestod af hvid toast (2 skiver Sainsburys medium hvide brød) og smør (ca. 16 g Bertolli/Vitalite (et vegansk alternativ, matchet så tæt som muligt for kalorier og makronæringsstofindhold)). Deltagerne fik vand til at drikke ad-libitum under testbesøgene, dette blev målt og genopfyldt fra baseline og 1, 2, 3, 5 og 8 timer efter morgenmad og tilskudsindtagelse.

Blodtryksovervågning Blodtrykket blev overvåget under hele testbesøgene, umiddelbart efter ankomsten til laboratoriet og 1, 2, 3, 5 og 8 timer efter indtagelse af tilskuddet (Keane, George, et al., 2016).

Blodprøvetagningsprocedure Venøse blodprøver (~10 ml) blev opsamlet fra den antecubitale fossa i lithiumheparin (10 ml) rør umiddelbart efter ankomst til laboratoriet og 1, 2, 3, 5 og 8 timer efter indtagelse af tilskuddet. Prøver blev straks centrifugeret (3000 x g) ved 4 °C i 20 minutter, plasma blev derefter aspireret og pipetteret i ~1 ml alikvoter og derefter straks opbevaret ved -80 °C til senere analyse.

Ikke-målrettet plasmaanalyse Prøven blev fremstillet ved først at blive optøet på is, derefter blev 200 µL plasma ekstraheret og vortexbehandlet med 1000 µL methanol af analytisk kvalitet, derefter sonikeret i et vandisbad i 15 minutter. Prøverne blev derefter centrifugeret i 15 minutter ved 15.000 rpm ved 4°C, før supernatanten blev tørret i en vakuumprækoncentrator til tørhed i 3 timer. Resten blev rekonstitueret i 100 µL vand af analytisk kvalitet (hvirvel i 30 s og sonikeret i 15 minutter), før den blev filtreret via 0,22 mikron Costar-spinfilter og anbragt i 1,5 ml autosampler-hætteglas med en 200 µL mikroindsats.

Metabolitkarakteriseringer blev udført på en LCMS (Vanquish Liquid chromatography Frontend forbundet til IDX High Resolution Mass Spectrometer system, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Storbritannien). MS-dataene blev erhvervet ved hjælp af AcquieX-indsamlingsarbejdsgangen (dataafhængig analyse). MS driftsparametre var som følger: MS1 masseopløsning 60K, for MS2 30K stepped energy (HCD) 20,25,50 scanningsområde 100-1000, RF len (%) 35, AGC gain, intensitetstærskel 2e4 25% brugerdefineret injektionstilstand med en injektionstid på 54 ms. En ekstraktionsblank blev brugt til at oprette en baggrundseksklusionsliste, og en poolet QC blev brugt til at oprette inklusionslisten. C18 RP, den kromatografiske adskillelse blev arkiveret ved hjælp af en Waters Acquity UPLC T3 HSS-søjle (2,1 x 150 mm med partikelstørrelse på 1,7 μm), der fungerede ved 45°C med en strømningshastighed på 200 μL/min. LC-gradienten består af binært buffersystem, buffer A (LC/MS kvalitet vand/ACN 95/5 v/v) og buffer B (LC/MS kvalitet ACN/Vand 95/5 v/v). Uafhængigt buffersystem blev brugt til positiv og negativ modus erhvervelse, pH-værdien af ​​buffere blev justeret under anvendelse af 0,1% myresyre for begge. LC-gradienten var den samme for begge polariteter, 5 % B ved T0 holdes i 1,5 min. og lineært fald til 95 % B ved 11 min. hold i 4 minutter og vende tilbage til starttilstanden og holdes i yderligere 4,5 minutter (søjlestabilisering). Spændingen anvendt for positiv tilstand var 3,5 kV og injektionsvolumen var 3 μL. HESI-betingelserne var som følger for 200 μL: kappegas: 35, hjælpegas 7 og skyllegas på 0. Ionoverføringsrørets temperatur var 300°C, og fordampertemperaturen var 275°C.

Dataanalyse Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Beskrivende statistik rapporteres som middel ± SD. BP blev analyseret under anvendelse af en behandling (lav vs. høj dosis vs. placebo) efter tid (baseline, 1, 2, 3, 5 og 8 timer efter tilskud) gentagne mål variansanalyse (RMANOVA). Mauchlys test af sfæricitet blev brugt til at kontrollere variansens homogenitet for alle variable; hvor det var nødvendigt, blev eventuelle overtrædelser af antagelsen korrigeret ved hjælp af Greenhouse-Geisser-justeringen. Signifikante interaktionseffekter blev fulgt op ved hjælp af post hoc analyse. Alfa-niveauet for statistisk signifikans blev sat til 0,05.