Zmiany w metabolomie wywołane osoczem po spożyciu polifenoli

Uczestnicy Do tego badania zrekrutowano dwunastu zdrowych uczestników (dziewięciu mężczyzn i trzy kobiety); średni ± SD wiek, wzrost, masa i wskaźnik masy ciała (BMI) wynosiły odpowiednio 29 ± 7 lat, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg i 25,23 ± 1,87 kg/m2. Wszyscy uczestnicy byli zdrowi, co oceniono za pomocą kwestionariusza przesiewowego stanu zdrowia i wyrazili pisemną, świadomą zgodę. Kryteriami wykluczenia z badania były: alergia pokarmowa (omawiana z zespołem badawczym), przebyta choroba przewodu pokarmowego, nerek, układu krążenia lub tarczycy oraz aktualne stosowanie jakichkolwiek suplementów diety. Badanie to uzyskało aprobatę etyczną Komisji Etyki Uniwersytetu Northumbria (numer referencyjny: 39904) (badanie kliniczne do potwierdzenia).

Projekt eksperymentu W badaniu wykorzystano podwójnie ślepy, trójramienny, krzyżowy, pseudorandomizowany (równoważony w celu wyeliminowania efektów kolejności) projekt w celu zidentyfikowania zmian metabolomicznych po ostrym przyjęciu małej dawki (NISKIEJ) i dużej dawki ( HI) TC lub placebo (CON). Zastosowano okres wymywania wynoszący co najmniej 7 dni (ale nie więcej niż 21 dni) pomiędzy każdą fazą. Uczestnicy byli zobowiązani do obecności na początku każdej fazy badania o godzinie 7:45 po 10-godzinnym poszczeniu nocnym, aby uwzględnić zmienność dobową (ryc. 1). Po przybyciu do laboratorium uczestnikom rejestrowano podstawowe ciśnienie krwi (BP) w stanie spoczynku (po co najmniej 5 minutach siedzenia), a następnie wprowadzano kaniulę w celu seryjnego pobierania próbek krwi. Następnie podano standardowe śniadanie. Następnie wykonano kolejne pomiary na początku badania, 1, 2, 3, 5 i 8 godzin po zużyciu VTC. Wodę podawano do woli, ale podczas wizyt testowych nie podawano żadnego dodatkowego pożywienia.

Leczenie i kontrola diety Dawka niska (LOW) i wysoka (HI) składała się odpowiednio z 3 lub 6 g suplementu TC (CherryCraft) lub 3 g kapsułki placebo (CON) dopasowanej pod względem kalorycznym z użyciem maltodekstryny. Niska dawka TC dostarczała około 60-78 mg antocyjanów, 8,07 kcal i miała zawartość makroskładników odżywczych odpowiednio 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g dla węglowodanów, tłuszczu i białka. Wysoka dawka TC dostarczyła około 120-156 mg antocyjanów, 16,14 kcal przy 2,43 g, 0,006 g, 0,08 g odpowiednio węglowodanów, tłuszczu i białka.

Uczestnicy zostali poproszeni o przestrzeganie swojej zwykłej diety przez cały czas trwania badania. Dzienniki posiłków wypełniano na 24 godziny przed każdą wizytą testową w celu powtórzenia (w miarę zbliżenia) przed badaniem podczas kolejnych wizyt testowych. Standardowe śniadanie składało się z białego tostu (2 kromki średniego białego chleba Sainsbury's) i masła (ok. 16g Bertolli/Vitalite (wegańska alternatywa, maksymalnie dopasowana pod względem kalorii i zawartości makroskładników)). Uczestnikom podawano wodę do picia do woli podczas wizyt testowych, mierzono ją i uzupełniano w stosunku do wartości wyjściowych oraz 1, 2, 3, 5 i 8 godzin po śniadaniu i przyjęciu suplementu.

Monitorowanie ciśnienia krwi Ciśnienie krwi monitorowano podczas wizyt testowych, bezpośrednio po przybyciu do laboratorium oraz 1, 2, 3, 5 i 8 godzin po spożyciu suplementu (Keane, George i in., 2016).

Procedura pobierania krwi Próbki krwi żylnej (~10 ml) pobierano z dołu łokciowego do probówek z heparyną litową (10 ml) natychmiast po przybyciu do laboratorium oraz 1, 2, 3, 5 i 8 godzin po przyjęciu suplementu. Próbki natychmiast odwirowano (3000 x g) w temperaturze 4°C przez 20 minut, następnie odessano osocze i pipetowano do porcji ~1 ml, a następnie natychmiast przechowywano w temperaturze -80°C do późniejszej analizy.

Nieukierunkowana analiza osocza Próbkę przygotowano przez rozmrożenie na lodzie, następnie 200 µl osocza wyekstrahowano i wirowano z 1000 µl metanolu o czystości analitycznej, a następnie poddano działaniu ultradźwięków w łaźni wodno-lodowej przez 15 minut. Próbki następnie wirowano przez 15 minut przy 15 000 obr./min w temperaturze 4°C, po czym supernatant wysuszono w próżniowym zagęszczaczu wstępnym do suchości przez 3 godziny. Pozostałość roztworzono w 100 µl wody o czystości analitycznej (wirowano przez 30 s i poddano sonikacji przez 15 minut), po czym przefiltrowano przez filtr wirowy Costar o średnicy porów 0,22 mikrona i umieszczono w 1,5 ml fiolce automatycznego podajnika próbek z mikrowkładką o pojemności 200 µl.

Charakterystykę metabolitów przeprowadzono na LCMS (chromatografia cieczowa Vanquish Front end podłączona do systemu spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości IDX, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Wielka Brytania). Dane MS uzyskano przy użyciu przepływu pracy akwizycji AcquieX (analiza zależna od danych). Parametry operacyjne MS były następujące: rozdzielczość masowa MS1 60K, dla MS2 30K energia schodkowa (HCD) 20,25,50 zakres skanowania 100-1000, długość RF (%) 35, wzmocnienie AGC, próg intensywności 2e4 25% niestandardowy tryb wtrysku z czasem wtrysku 54 ms. Do utworzenia listy wykluczeń tła wykorzystano ślepą próbę ekstrakcyjną, a do utworzenia listy włączeń wykorzystano zbiorczą kontrolę jakości. C18 RP, rozdział chromatograficzny archiwizowano przy użyciu kolumny Waters Acquity UPLC T3 HSS (2,1 x 150 mm z wielkością cząstek 1,7 µm), pracującej w temperaturze 45°C z szybkością przepływu 200 µl/min. Gradient LC składa się z binarnego układu buforów, buforu A (woda klasy LC/MS/ACN 95/5 v/v) i buforu B (ACN klasy LC/MS/woda 95/5 v/v). Do akwizycji trybu dodatniego i ujemnego zastosowano niezależny układ buforów, pH buforów regulowano za pomocą 0,1% kwasu mrówkowego w obu przypadkach. Gradient LC był taki sam dla obu polaryzacji, 5% B w T0 utrzymywano przez 1,5 minuty i liniowo zmniejszano do 95% B przy 11 minutach, utrzymywano przez 4 minuty i wracano do warunków wyjściowych i utrzymywano przez dalsze 4,5 minuty (stabilizacja kolumny). Napięcie przyłożone dla trybu dodatniego wynosiło 3,5 kV, a objętość wtrysku wynosiła 3 µl. Warunki HESI były następujące dla 200 µl: gaz osłonowy: 35, gaz pomocniczy 7 i gaz oczyszczający 0. Temperatura rury przenoszącej jony wynosiła 300°C, a temperatura parownika 275°C.

Analiza danych Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Statystyki opisowe przedstawiono jako średnią ± SD. BP analizowano przy użyciu leczenia (niska vs. wysoka dawka vs. placebo) według czasu (punkt wyjściowy, 1, 2, 3, 5 i 8 godzin po suplementacji) metodą analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (RMANOVA). Do sprawdzenia jednorodności wariancji dla wszystkich zmiennych wykorzystano test sferyczności Mauchly'ego; tam, gdzie było to konieczne, wszelkie naruszenia założeń skorygowano za pomocą korekty Greenhouse’a-Geissera. Znaczące efekty interakcji monitorowano za pomocą analizy post hoc. Poziom alfa dla istotności statystycznej ustalono na 0,05.