多酚消耗后血浆引起的代谢组变化

参与者 本研究招募了 12 名健康参与者（九名男性和三名女性）；年龄、身高、体重和体重指数（BMI）的平均值±SD分别为29±7岁、174.8±9.3cm、77.29±10.52kg和25.23±1.87kg/m2。 根据健康筛查问卷的评估，所有参与者都是健康的，并提供了书面知情同意书。 该研究的排除标准如下：食物过敏（与研究团队讨论）、胃肠道、肾脏、心血管或甲状腺疾病史以及目前使用任何食品补充剂。 本研究获得诺森比亚大学伦理委员会的伦理批准（参考号：39904）（临床试验待定）。

实验设计该研究采用双盲、三臂交叉、伪随机（平衡以消除顺序效应）设计，以确定急性摄入低剂量（LOW）、高剂量（ TC 或安慰剂 (CON) 的 HI)。 每个阶段之间的清洗期至少为 7 天（但不超过 21 天）。 参与者被要求在 10 小时过夜禁食后于上午 7:45 开始每个阶段的研究，以考虑昼夜变化（图 1）。 到达实验室后，参与者在休息状态下（至少坐 5 分钟后）记录基线血压 (BP)，然后插管进行连续血液采样。 然后提供标准化早餐。 随后在基线、服用 VTC 后 1、2、3、5 和 8 小时进行后续测量。 随意提供水，但在测试期间不提供额外的食物。

治疗和饮食控制低（LOW）和高（HI）剂量分别由3或6克TC补充剂（CherryCraft）组成，或使用麦芽糖糊精与热量含量相匹配的3克胶囊安慰剂（CON）。 低 TC 剂量提供约 60-78 毫克花青素、8.07 kcal，常量营养素含量分别为 1.215 克、0.003 克、0.042 克（碳水化合物、脂肪和蛋白质）。 高TC剂量提供约120-156毫克花青素、16.14大卡，碳水化合物、脂肪和蛋白质分别为2.43克、0.006克、0.08克。

要求参与者在整个试验过程中遵循他们的习惯饮食。 每次测试访问前 24 小时内完成食物日记，以便在后续测试访问中复制（尽可能接近）测试前的情况。 标准化的早餐包括白吐司（2片塞恩斯伯里的中号白面包）和黄油（约10克）。 16 克 Bertolli/Vitalite（纯素替代品，卡路里和常量营养素含量尽可能匹配）。 在整个测试访问期间，参与者可以随意饮用水，这是根据基线以及早餐和补充剂摄入后 1、2、3、5 和 8 小时进行测量和补充的。

血压监测 在整个测试访问期间、到达实验室后立即监测血压，以及摄入补充剂后 1、2、3、5 和 8 小时监测血压（Keane、George 等，2016）。

血液采样程序 到达实验室后立即以及摄入补充剂后 1、2、3、5 和 8 小时将静脉血样（~10 mL）从肘前窝收集到肝素锂（10 mL）管中。 立即将样品在 4°C 下离心 (3000 × g) 20 分钟，然后吸出血浆并移液至约 1 mL 等分试样中，然后立即储存在 -80°C 下以供后续分析。

非靶向血浆分析 样品的制备方法是首先在冰上解冻，然后提取 200 µL 血浆并与 1000 µL 分析纯甲醇涡旋，然后在水冰浴中超声处理 15 分钟。 然后将样品在 4°C 下以 15,000 rpm 离心 15 分钟，然后将上清液在真空预浓缩器中干燥 3 小时至干。 将残留物在 100 µL 分析级水中重构（涡旋 30 秒，超声处理 15 分钟），然后通过 0.22 微米 Costar 旋转过滤器过滤，并放入带有 200 µL 微插入器的 1.5 mL 自动进样器小瓶中。

代谢物表征在 LCMS（连接到 IDX 高分辨率质谱仪系统的 Vanquish 液相色谱前端，Thermo Scientific，Hemel Hempstead，英国）上进行。 使用 AcquieX 采集工作流程（数据相关分析）采集 MS 数据。 MS 操作参数如下： MS1 质量分辨率 60K，MS2 30K 步进能量 (HCD) 20,25,50 扫描范围 100-1000，RF 透镜 (%) 35，AGC 增益，强度阈值 2e4 25% 自定义进样模式注射时间为 54 ms。 使用提取空白创建背景排除列表，并使用合并的 QC 创建包含列表。 C18 RP，色谱分离采用 Waters Acquity UPLC T3 HSS 色谱柱（2.1 x 150mm，粒径为 1.7 μm）进行存档，操作温度为 45°C，流速为 200 μL/min。 LC 梯度由二元缓冲液系统、缓冲液 A（LC/MS 级水/ACN 95/5 v/v）和缓冲液 B（LC/MS 级 ACN/水 95/5 v/v）组成。 独立的缓冲系统用于正负模式采集，缓冲液的pH值均使用0.1%甲酸调节。 两种极性的 LC 梯度相同，T0 时 5% B 保持 1.5 分钟，并在 11 分钟时线性下降至 95%B，保持 4 分钟，然后返回起始条件并进一步保持 4.5 分钟（柱稳定）。 正向模式施加的电压为3.5 kV，注射体积为3 μL。 对于200μL，HESI条件如下：鞘气：35，辅助气7，吹扫气0。离子传输管温度为300℃，蒸发器温度为275℃。

数据分析使用SPSS（SPSS，Inc.，Chicago，IL）进行统计分析。 描述性统计数据以平均值±标准差报告。 使用治疗（低剂量与高剂量与安慰剂）按时间（基线、补充后 1、2、3、5 和 8 小时）重复测量方差分析 (RMANOVA) 来分析血压。 使用莫奇利球形检验来检查所有变量的方差齐性；必要时，使用 Greenhouse-Geisser 调整来纠正任何违反假设的情况。 使用事后分析跟踪显着的交互作用。 统计显着性的α水平设定为0.05。