Плазменные изменения в метаболоме после потребления полифенолов

Участники Для этого исследования были привлечены двенадцать здоровых участников (девять мужчин и три женщины); средний ± стандартное отклонение возраста, роста, массы и индекса массы тела (ИМТ) составили 29 ± 7 лет, 174,8 ± 9,3 см, 77,29 ± 10,52 кг и 25,23 ± 1,87 кг/м2 соответственно. Все участники были здоровы по данным анкеты для проверки здоровья и предоставили письменное информированное согласие. Критериями исключения из исследования были следующие: пищевая аллергия (согласно обсуждению с исследовательской группой), желудочно-кишечные, почечные, сердечно-сосудистые заболевания или заболевания щитовидной железы в анамнезе, а также использование любых пищевых добавок в настоящее время. Это исследование получило этическое одобрение от Комитета по этике Университета Нортумбрии (номер ссылки: 39904) (клиническое исследование будет подтверждено позднее).

План эксперимента В исследовании использовался двойной слепой, трехсторонний перекрестный, псевдорандомизированный (сбалансированный для устранения эффектов порядка) дизайн с целью выявления метаболомических сдвигов после острого приема низкой дозы (НИЗКОЙ), высокой дозы ( HI) TC или плацебо (CON). Между каждой фазой был реализован период отмывания продолжительностью не менее 7 дней (но не более 21 дня). Участники должны были присутствовать в начале каждого этапа исследования в 7:45 утра после 10-часового ночного голодания, чтобы учесть суточные колебания (рис. 1). По прибытии в лабораторию у участников измеряли исходное артериальное давление (АД) в состоянии покоя (после не менее 5 минут сидения), а затем канюлировали для серийного взятия проб крови. Затем был предоставлен стандартизированный завтрак. Последующие измерения затем проводились на исходном уровне, через 1, 2, 3, 5 и 8 часов после употребления VTC. Воду давали вволю, но во время тестовых визитов никакой дополнительной еды не давали.

Лечение и диетический контроль Низкая (LOW) и высокая (HI) доза состояла из 3 или 6 г добавки TC (CherryCraft) соответственно или 3 г капсулы плацебо (CON), подобранной по калорийности с использованием мальтодекстрина. Низкая доза TC обеспечивала приблизительно 60-78 мг антоцианов, 8,07 ккал, и имела содержание макронутриентов 1,215 г, 0,003 г, 0,042 г для углеводов, жиров и белков соответственно. Высокая доза ТС обеспечивала примерно 120-156 мг антоцианов, 16,14 ккал при 2,43 г, 0,006 г, 0,08 г углеводов, жиров и белков соответственно.

Участникам было предложено соблюдать свою привычную диету на протяжении всего исследования. Дневники питания заполнялись в течение 24 часов перед каждым посещением для тестирования, чтобы воспроизвести (как можно ближе) до тестирования при последующих посещениях для тестирования. Стандартный завтрак состоял из белых тостов (2 ломтика среднего белого хлеба Sainsbury) и сливочного масла (ок. 16 г Bertolli/Vitalite (веганская альтернатива, максимально приближенная по калориям и содержанию макронутриентов)). Участникам давали воду для питья в неограниченном количестве во время тестовых посещений, ее измеряли и дополняли от исходного уровня, а также через 1, 2, 3, 5 и 8 часов после завтрака и приема добавок.

Мониторинг артериального давления. Артериальное давление контролировалось во время тестовых посещений, сразу по прибытии в лабораторию и через 1, 2, 3, 5 и 8 часов после приема добавки (Keane, George и др., 2016).

Процедура отбора проб крови Образцы венозной крови (~10 мл) собирали из локтевой ямки в пробирки с литий-гепарином (10 мл) сразу по прибытии в лабораторию и через 1, 2, 3, 5 и 8 часов после приема добавки. Образцы немедленно центрифугировали (3000×g) при 4°C в течение 20 мин, затем плазму аспирировали и пипетировали в аликвоты ~1 мл, а затем сразу же хранили при -80°C для последующего анализа.

Нецелевой анализ плазмы. Образец готовили путем сначала оттаивания на льду, затем 200 мкл плазмы экстрагировали и перемешивали на вортексе с 1000 мкл метанола аналитической чистоты, а затем обрабатывали ультразвуком на водяной ледяной бане в течение 15 минут. Затем образцы центрифугировали в течение 15 мин при 15 000 об/мин при 4°С, а затем супернатант сушили в вакуумном преконцентраторе досуха в течение 3 часов. Остаток восстанавливали в 100 мкл воды аналитической чистоты (перемешивали в течение 30 с и обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин), затем фильтровали через спин-фильтр Costar с размером пор 0,22 микрона и помещали в флакон для автосамплера емкостью 1,5 мл с микровставкой на 200 мкл.

Характеристики метаболитов выполняли с помощью ЖХМС (передняя часть жидкостной хроматографии Vanquish, подключенная к системе масс-спектрометра высокого разрешения IDX, Thermo Scientific, Хемел-Хемпстед, Великобритания). Данные МС были получены с использованием рабочего процесса сбора данных AcquieX (анализ, зависящий от данных). Рабочие параметры МС были следующими: массовое разрешение МС1 60К, для МС2 30К ступенчатая энергия (HCD) 20,25,50, диапазон сканирования 100-1000, RF len (%) 35, усиление АРУ, порог интенсивности 2e4 25% пользовательский режим ввода с временем инжекции 54 мс. Бланк экстракции использовался для создания списка фоновых исключений, а объединенный контроль качества использовался для создания списка включения. C18 RP, результаты хроматографического разделения архивировали с использованием колонки Waters Acquity UPLC T3 HSS (2,1 x 150 мм с размером частиц 1,7 мкм), работающей при 45°C и скорости потока 200 мкл/мин. Градиент ЖХ состоит из бинарной буферной системы, буфера A (вода класса LC/MS/ACN 95/5 по объему) и буфера B (класс ACN для ЖХ/МС/вода 95/5 по объему). Независимую систему буферов использовали для получения положительных и отрицательных режимов, pH буферов регулировали с использованием 0,1% муравьиной кислоты для обоих. Градиент ЛК был одинаковым для обеих полярностей: 5% B при Т0 удерживался в течение 1,5 мин и линейно уменьшался до 95% B при 11 мин, выдерживался в течение 4 мин, а затем возвращался к исходному состоянию и удерживался еще в течение 4,5 мин (стабилизация колонки). Напряжение, приложенное для положительного режима, составляло 3,5 кВ, а объем инъекции составлял 3 мкл. Условия HESI были следующими для 200 мкл: защитный газ: 35, вспомогательный газ 7 и продувочный газ 0. Температура ионообменной трубки составляла 300°C, а температура испарителя - 275°C.

Анализ данных Статистический анализ проводили с использованием SPSS (SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс). Описательная статистика представлена ​​как среднее ± SD. АД анализировали с использованием лечения (низкая, высокая доза или плацебо) по времени (исходный уровень, 1, 2, 3, 5 и 8 часов после приема добавки) и дисперсионному анализу повторных измерений (RMANOVA). Тест сферичности Мокли использовался для проверки однородности дисперсии для всех переменных; при необходимости любые нарушения допущения корректировались с помощью поправки Гринхауса-Гейссера. Значительные эффекты взаимодействия отслеживались с помощью апостериорного анализа. Уровень альфа для статистической значимости был установлен на уровне 0,05.