Cambios en el metabolismo inducidos por plasma después del consumo de polifenoles

Participantes Para este estudio se reclutaron doce participantes sanos (nueve hombres y tres mujeres); la media ± DE de edad, estatura, masa e índice de masa corporal (IMC) fue 29 ± 7 años, 174,8 ± 9,3 cm, 77,29 ± 10,52 kg y 25,23 ± 1,87 kg/m2, respectivamente. Todos los participantes estaban sanos, según lo evaluado mediante un cuestionario de evaluación de salud y proporcionaron su consentimiento informado por escrito. Los criterios de exclusión para el estudio fueron los siguientes: alergia alimentaria (según lo discutido con el equipo de investigación), antecedentes de enfermedad gastrointestinal, renal, cardiovascular o tiroidea y uso actual de cualquier complemento alimenticio. Este estudio recibió la aprobación ética del Comité de Ética de la Universidad de Northumbria (número de referencia: 39904) (ensayo clínico por confirmar).

Diseño experimental El estudio utilizó un diseño doble ciego, cruzado de tres brazos, pseudoaleatorio (contrapesado para eliminar los efectos del orden) para identificar cambios metabólicos después de la ingestión aguda de una dosis baja (BAJA), una dosis alta ( HI) de TC o placebo (CON). Se implementó un período de lavado de al menos 7 días (pero no más de 21 días) entre cada fase. Se pidió a los participantes que asistieran al inicio de cada fase del estudio a las 7:45 am después de un ayuno nocturno de 10 h para tener en cuenta la variación diurna (Figura 1). Al llegar al laboratorio, se registró la presión arterial (PA) inicial de los participantes en estado de reposo (después de al menos 5 minutos de estar sentados) y luego se canuló para tomar muestras de sangre en serie. Luego se proporcionó un desayuno estandarizado. Luego se tomaron medidas posteriores al inicio, 1, 2, 3, 5 y 8 horas después del consumo de VTC. Se proporcionó agua ad libitum, pero no se proporcionó comida adicional durante las visitas de prueba.

Tratamientos y control dietético La dosis baja (BAJA) y alta (HI) consistió en 3 o 6 g del suplemento TC (CherryCraft), respectivamente, o una cápsula de placebo (CON) de 3 g equivalente en contenido calórico usando maltodextrina. La dosis baja de TC proporcionó aproximadamente 60-78 mg de antocianinas, 8,07 kcal y tuvo un contenido de macronutrientes de 1,215 g, 0,003 g, 0,042 g, de carbohidratos, grasas y proteínas, respectivamente. La dosis alta de TC proporcionó aproximadamente 120-156 mg de antocianinas, 16,14 kcal con 2,43 g, 0,006 g, 0,08 g de carbohidratos, grasas y proteínas, respectivamente.

Se pidió a los participantes que siguieran su dieta habitual durante todo el ensayo. Se completaron diarios de alimentos durante las 24 horas anteriores a cada visita de prueba para replicarlos (lo más cerca posible) antes de la prueba en las siguientes visitas de prueba. El desayuno estandarizado consistía en tostadas blancas (2 rebanadas de pan blanco mediano Sainsbury's) y mantequilla (aprox. 16 g de Bertolli/Vitalite (una alternativa vegana, lo más parecida posible en cuanto a calorías y contenido de macronutrientes)). A los participantes se les dio agua para beber ad libitum durante las visitas de prueba, esto se midió y se rellenó desde el inicio y 1, 2, 3, 5 y 8 horas después del desayuno y la ingesta de suplementos.

Monitoreo de la presión arterial La presión arterial se controló durante las visitas de prueba, inmediatamente después de la llegada al laboratorio y 1, 2, 3, 5 y 8 horas después de la ingestión del suplemento (Keane, George, et al., 2016).

Procedimiento de muestreo de sangre Se recogieron muestras de sangre venosa (~10 ml) de la fosa antecubital en tubos de heparina de litio (10 ml), inmediatamente después de su llegada al laboratorio y 1, 2, 3, 5 y 8 horas después de la ingestión del suplemento. Las muestras se centrifugaron inmediatamente (3000 x g) a 4 °C durante 20 minutos, luego se aspiró el plasma y se pipeteó en alícuotas de aproximadamente 1 ml y luego se almacenó inmediatamente a -80 °C para su posterior análisis.

Análisis de plasma no dirigido La muestra se preparó descongelándola primero en hielo, luego se extrajeron 200 µl de plasma y se agitaron con 1000 µl de metanol de grado analítico, luego se sonicó en un baño de agua con hielo durante 15 minutos. Luego, las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a 15.000 rpm a 4°C, antes de que el sobrenadante se secara en un preconcentrador de vacío hasta sequedad durante 3 h. El residuo se reconstituyó en 100 µl de agua de calidad analítica (vortex durante 30 s y sonicación durante 15 minutos), antes de filtrarse mediante un filtro giratorio Costar de 0,22 micrones y colocarse en un vial de muestreador automático de 1,5 ml con un microinserto de 200 µl.

Las caracterizaciones de los metabolitos se realizaron en un LCMS (frontal de cromatografía líquida Vanquish conectado al sistema de espectrómetro de masas de alta resolución IDX, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Reino Unido). Los datos de MS se adquirieron utilizando el flujo de trabajo de adquisición AcquieX (análisis dependiente de los datos). Los parámetros operativos de MS fueron los siguientes: resolución de masa de MS1 60K, para MS2 30K energía escalonada (HCD) 20,25,50 rango de escaneo 100-1000, lente de RF (%) 35, ganancia de AGC, umbral de intensidad 2e4 25% modo de inyección personalizado con un tiempo de inyección de 54 ms. Se utilizó un blanco de extracción para crear una lista de exclusión de antecedentes y se utilizó un control de calidad combinado para crear la lista de inclusión. C18 RP, la separación cromatográfica se archivó utilizando una columna Waters Acquity UPLC T3 HSS (2,1 x 150 mm con tamaño de partícula de 1,7 μm), operando a 45 °C con un caudal de 200 μL/min. El gradiente de LC consta de un sistema de tampón binario, tampón A (agua de grado LC/MS/ACN 95/5 v/v) y tampón B (ACN de grado LC/MS/agua 95/5 v/v). Se utilizó un sistema de tampones independientes para la adquisición en modo positivo y negativo, el pH de los tampones se ajustó utilizando ácido fórmico al 0,1% para ambos. El gradiente de LC fue el mismo para ambas polaridades, 5% de B en T0 mantenido durante 1,5 minutos y disminución lineal a 95% de B en 11 minutos mantenido durante 4 minutos y volver a la condición inicial y mantener durante 4,5 minutos más (estabilización de columna). El voltaje aplicado para el modo positivo fue de 3,5 kV y el volumen de inyección fue de 3 μL. Las condiciones de HESI fueron las siguientes para 200 µL: gas envolvente: 35, gas auxiliar 7 y gas de barrido 0. La temperatura del tubo de transferencia de iones fue de 300 °C y la temperatura del vaporizador fue de 275 °C.

Análisis de datos El análisis estadístico se realizó utilizando SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL.). Las estadísticas descriptivas se informan como media ± DE. La PA se analizó mediante un análisis de varianza de medidas repetidas (RMANOVA) del tratamiento (dosis baja versus alta versus placebo) por tiempo (línea de base, 1, 2, 3, 5 y 8 horas después del suplemento). Se utilizó la prueba de esfericidad de Mauchly para comprobar la homogeneidad de la varianza de todas las variables; cuando fue necesario, cualquier violación del supuesto se corrigió utilizando el ajuste de Greenhouse-Geisser. Los efectos de interacción significativos se siguieron mediante análisis post hoc. El nivel alfa de significación estadística se fijó en 0,05.