尿および尿路上皮内の微生物叢は膀胱がんの誘発因子となる可能性があります。この研究では、全ゲノム配列決定技術と16S rRNAを使用して、男性患者の尿および膀胱がん組織と対照者の尿を検査する。目的は膀胱内の微生物叢の役割を解明すること (Cancer bladder)

-根拠と目的:

A- 膀胱がん:

理論的根拠 膀胱がんは悪性疾患の中で 9 番目に多いと推定されており、世界中で年間 160,000 人以上が死亡していると推定されています。

尿路に生息する微生物が健康の維持、病気や膀胱がんの発症に重要な役割を果たしているという認識がますます高まっています[1]。

膀胱癌の発症と特定の微生物因子との間には十分に確立された相関関係がある[2、3、4、5、]。

宿主 DNA の損傷は、特定の大腸菌株によって産生される遺伝毒素を介して直接開始されることもあれば、酸化種の開始による間接的な経路を介して開始されることもあります。 マイクロバイオームとその産物には抗がん作用があります[6]。

伝統的に、健康な人の尿および膀胱尿路上皮は無菌であると考えられてきました。 この概念は、標準的な微生物学的尿培養に基づいています。 最近、尿路にも異なる共生微生物が存在するという証拠と証拠が蓄積されています。 尿中マイクロバイオームは健康な人でも報告されています[7]。

膀胱癌における尿中マイクロバイオームはあまり調査されておらず、一部の膀胱癌患者の膀胱には連鎖球菌属が濃縮されていることが報告されていた[8]。

Bučević Popović V et al [1] は次のように報告しています:「膀胱癌の男性患者および健康な個人からの尿検体に存在する細菌群集を 16S シーケンスを使用して分析しました。 結果は、両方のグループで最も多く存在する門はファーミクテス属であり、次に放線菌、バクテロイデス属、プロテオバクテリウムが続いたことが示されています。 膀胱癌では、腫瘍形成促進性病原体の可能性があるフソバクテリウム属が著しく濃縮されていました。 膀胱がん組織では、PCR によって検出された Fusobacterium nucleatum 配列、Veillonella 属、Streptococcus 属、および Corynebacterium 属が健康な尿中により豊富に含まれていました。 カンピロバクター・ホミニスは膀胱癌患者の尿サンプル中に濃縮されており、カンピロバクター種は毒素を産生し、上皮細胞に侵入し、宿主の免疫反応を回避できるため、潜在的に病原性がある。」

微生物叢はヒト宿主に腫瘍抑制効果をもたらす可能性があります [6]。 次世代シーケンス (NGS) テクノロジーにより、特定の生息地における微生物群集のプロファイリングが可能になりました。 16S リボソーム RNA (rRNA) 遺伝子配列決定は、NGS テクノロジーによる微生物叢プロファイリングに使用されます。 微生物叢プロファイリング研究では、どの 16S rRNA 超可変領域をシーケンスするかを選択することが重要です。 9 つの 16S rRNA 超可変領域はすべて分類学的に有益ですが、特にプロファイリングのパフォーマンスにはばらつきがあるため、理想的な 16S rRNA 超可変領域の選択は、研究対象の生息地の細菌組成に依存します。 尿路 (ウロバイオーム) に定着している微生物群集は V4、V5 で確認されます。 最近の研究では、ウロバイオーム ディスバイオーシスがいくつかの泌尿器科疾患 [9、10、11] および膀胱がん [12] に関連していることが示されています。

目的: したがって、健康と膀胱がんにおけるウロバイオームの特徴を明らかにすることは極めて重要であり、膀胱がんの新たな予防、診断、治療戦略につながる可能性があります。

目的 この調査研究の目的は、膀胱がんの成人男性患者の尿中の微生物叢を特徴づけ、健康な成人男性の対照における微生物叢と相関関係を明らかにすることです。

2-方法論 2-1 研究の種類: 前向き症例対照研究 2-2 対象、除外基準、採用プロセス。 [研究に参加する患者にはインフォームドコンセントの提供が求められます。泌尿器科のローアイ・モスタファ医師とモハメド・サハブ医師がこの項目を担当します]。

包含基準:

• 18歳以上の成人男性、
• 画像超音波検査および/またはコンピューター断層撮影および尿細胞診により膀胱癌と診断されている。
• 診断用膀胱鏡検査、以前の病理検査、または生検標本の病理学的検査のいずれかで膀胱がんが確認された。

除外基準:

• 膀胱または隣接臓器に対する以前の放射線治療。
• 過去にカルメット・ゲラン桿菌（BCG）を用いた膀胱内点滴免疫療法、または化学療法薬の膀胱内点滴注入。
• 以前の術前化学療法。 採用プロセス 除外基準と包含基準を満たす患者。 2-3 サンプルサイズ オンライン ソフトウェア (Sample Size Calculator) を使用したサンプル サイズ計算に従って、18 歳以上のエジプト人男性 38 名が TBRI 泌尿器科で採用されます。 正常な人から 10 個の尿サンプルが収集されます。

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 筋層非浸潤性膀胱がん（NMIBC）のサンプルサイズは 16 です。 これは、95% の信頼水準を得るには 16 回以上の測定/調査が必要であることを意味します。 筋層浸潤性膀胱癌（MIBC）の場合、サンプルサイズは 11 になります。 これは、95% の信頼水準を得るには 40 回以上の測定/調査が必要であることを意味します。 対照群のサンプルサイズは 11 になります。 これは、信頼水準 95% A を得るには 10 回以上の測定/調査が必要であることを意味します。TBRI 泌尿器科では 38 人の男性が採用されます。 オンライン ソフトウェア (Sample Size Calculator) を使用したサンプル サイズの計算による。 非筋層浸潤性膀胱癌 (NMIBC) の場合、サンプル サイズは 16 から 11 の尿サンプルが収集されます。 これは、実際の値が測定/調査値の ±17.53% 以内であるという 95% の信頼水準を得るには、16 回以上の測定/調査が必要であることを意味します。

筋層浸潤性膀胱癌（MIBC）の場合、サンプルサイズは 11 になります。 これは、実際の値が測定/調査値の ±30.36% 以内であるという 95% の信頼水準を得るには、11 回以上の測定/調査が必要であることを意味します。

対照群のサンプルサイズは 11 になります。 これは、実際の値が測定/調査値の ±30.36% 以内であるという 95% の信頼水準を得るには、11 回以上の測定/調査が必要であることを意味します。

普通の個人。 このサンプルは、膀胱がんにおけるマイクロバイオームの研究を表しています。

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 サンプル採取

膀胱がん:

研究サンプルの総数: この研究では、尿および組織サンプル中の微生物叢を調査するため、膀胱がん患者全員が (2 つのサンプル) を提供します。 対照群には尿サンプル（1サンプル）を与えます。 最近の研究では、正常な個人や膀胱癌患者の尿路上皮では微生物叢が検出されており、この微生物叢は尿（液体）の微生物叢とは異なることが示されました。

参考文献:

1. Mansour B、Monyók Á、Makra N、Gajdács M、Vadnay I、Ligeti B、Juhász J、Szabó D、Ostorházi E. 膀胱がん関連微生物叢: 尿と組織サンプルの違いを調べる。 Sci Rep. 2020 Jul 6;10(1):11042。 土井: 10.1038/s41598-020-67443-2。

2. Parra-Grande M、Oré-Arce M、Martínez-Priego L、D'Auria G、Rossello-Mora R、Lillo M、Sempere A、Lumbreras B、Sánchez-Hellín V. 膀胱がん患者の膀胱微生物叢のプロファイリング。 フロント微生物。 2022 2 7;12:718776。 土井：10.3389/fmicb.2021.718776。

   グループ I: 非筋浸潤性膀胱癌、患者 16 名、膀胱組織 16 名、尿サンプル 16 名。 合計 32 サンプル。 （この研究では、尿および組織サンプル中の微生物叢を調査するため、膀胱がん患者全員が（サンプルを 2 つ）提供することになります。 対照群には尿サンプル（1サンプル）を与えます。 最近の研究では、正常な個人および膀胱癌患者の尿路上皮では微生物叢が検出されており、この微生物叢は尿（液体）の微生物叢とは異なることが示されました。（参考文献: ）グループ II: 筋層浸潤性膀胱がん、患者 11 人。 22 個のサンプルのうち、11 個は膀胱組織用、11 個は同じ患者から採取した尿サンプル用です。 グループ III: 11 人の正常な成人: 尿サンプルは研究の対照群として機能します。

   参加者総数は38名です。

   マイクロバイオーム分析用のサンプル:

   サンプルは、消毒剤や洗剤の残留物がなく、漏れ防止の蓋がしっかりと閉まる清潔な漏れ防止容器に収集され、TBRI の微生物研究所で分析されるまで冷蔵庫に保存されます。

   膀胱鏡検査中に、マイクロバイオーム分析用の尿サンプル (50 ml) が収集されます。 サンプルは処理するまで -80 °C で保存されます。

   膀胱がん患者の組織サンプルと尿サンプル：膀胱鏡検査の標準的な診断手順に基づき、尿サンプルは完全な無菌条件下で収集され、膀胱腫瘍のある患者は経尿道的膀胱腫瘍切除術を受け、0.5x0.5 cmの組織サンプルが検査されます。マイクロバイオーム分析用。 サンプルは処理するまで -80 °C で保存されます。 ヘマトキシリンおよびエオシン染色による組織病理学的診断は、WHO 22 および EAU ガイドライン 2023 に従って、腫瘍の悪性度および病期について専門の病理学者によって行われます。 この手順は、非筋浸潤性尿路上皮がんと筋浸潤性尿路上皮がんの両方に適用されます。 膀胱がんに対して根治的膀胱切除術を受ける予定の患者もサンプル数に含まれます。

   病理学的研究用のサンプル:

   組織サンプルはホルマリンで固定され、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で検査されます。

   臨床情報 泌尿器科医は、切除された腫瘍全体の一部または膀胱切除標本の一部である適切な組織サンプルを提供します。 病理学的評価のために、病理医に有用な臨床情報を提供して、外科標本の取り扱いと処理における最適なアプローチを決定し、正確な病理レポートを作成します。

   泌尿器科医は次のように指定します。

   • 患者の人口統計データと臨床病歴、尿路感染症の病歴、再発性か散発性かどうか、膀胱細胞診（存在する場合）、腫瘍の最初の発現かどうか、そうでない場合は以前の管理の詳細。
   • 膀胱粘膜の膀胱鏡の外観。腫瘍の数、サイズ、位置、病変の形態学的特徴（乳頭状、充実性、または潰瘍性）を示します。
   • さらに生検を行った場合の残った粘膜の状態。

   これらの情報は、尿路上皮の正確な評価とマイクロバイオームの検索に必要です。 なぜなら、治療法は腫瘍の形態や正常に見える尿路上皮に影響を与える可能性があるからです。

   膀胱がんサンプルのレポート

   • 病理学的評価 病理学者は、膀胱組織生検からの細胞を検査することによって、膀胱がんが存在するかどうか、および膀胱がんの種類を診断します。 膀胱がんのさまざまな組織学的腫瘍タイプは、2022 年に修正された 2016 年の WHO による膀胱腫瘍分類 (Mazzucchelli et al. 2021) に従って報告される予定です。
   • 微生物学的評価: 尿および組織からの微生物の同定方法

   臨床細菌分離株のサンプル収集と培養条件:

   限られた数の微生物、主に好気性細菌や急速に増殖する細菌を検出します。

   細菌分離株の同定：分離株は、血液、マッコンキー寒天培地およびサバルーズ寒天培地上で培養することによって同定され、その後生化学検査、オキシダーゼ試験マンニトール、胆汁エスクリンおよびカタラーゼ試験を実施することによって同定されます。 すべての分離株は、Vitek 2 コンパクト システムを使用して種レベルまで識別されます。

   2-5 生化学および分子生物学の評価: 16S メタゲノム配列解析 全ゲノム配列決定 (WGS) がすべての症例に適用されます。方法論と品質管理は、小児がん病院 57357 のゲノムおよびメタゲノム センターに従って行われます。尿および組織サンプルの WGS および 16S シーケンス。

1- 尿および組織からの DNA の分離。 尿検体（50ml）を解凍し、7500g、4℃で10分間遠心分離します。 ペレットは、Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit を使用した DNA 抽出に使用され、メーカーのプロトコールに従って実行されます。 環境汚染を避けるために、尿サンプルおよび試薬のみの抽出コントロールからのすべての分離は PCR フード内で実行されます。 分離された DNA サンプルは、PCR 増幅まで -20 °C に置かれます。 DNAは、DeNovix dsDNA高感度アッセイキット(Illumina 2013)を使用して定量化されます。

2- PCR ベースの KABA KAPA ライブラリ定量キットには、Illumina プラットフォームでのシーケンシング用に調製された次世代シーケンシング (NGS) ライブラリの正確で信頼性が高く再現性のある qPCR ベースの定量に必要なすべての試薬が含まれています。 キットには、KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (さまざまな qPCR 機器用にさまざまなパッシブリファレンス色素を配合)、プラットフォーム固有のライブラリ定量プライマープレミックス、および事前希釈された DNA 標準セットが含まれます。

16S rRNA 遺伝子 V3-V4 領域は、Illumina アダプターとインデックス バーコードを組み込んだ融合プライマーで増幅されます。 PCR ステップでは、クラスターの生成とシーケンスに必要なインデックス 1 (i7) およびインデックス 2 (i5)、シーケンス、および共通アダプター (P5 および P7) が追加されます。 Bioanalyzer システムを使用した高感度 DNA 電気泳動は、NGS ライブラリーの品質管理分析を向上させるために行われます。 3-16S rRNA 遺伝子ライブラリーの調製と MiSeq シーケンス。 16S rDNA の PCR 増幅、配列決定および分析は、細菌の V3V4 領域をターゲットとする NGS Illumina MiSeq MiSeq Reagent Kit v3 (600 サイクル) によって実行されます。 16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンス (16S 解析) は、次世代シーケンス技術による微生物叢の解析に広く使用されています。 標準的な V3-V4 プライマー (V34) セットからの 16S 分析データは、膀胱微生物叢分析プロトコルを最適化します。 4- バイオインフォマティクスと統計分析。 注釈が付けられたゲノムは、バイオインフォマティック パイプラインを使用してさらに分析され、病原体の生物学と病気を引き起こす可能性についての洞察が得られます。 これには次のものが含まれます。

- エラーを除去しギャップを埋めることによるドラフトゲノムの品質管理と改善。

• 遺伝子の機能やその他の特徴の特定と説明を含む、最終ゲノムのアノテーション。
• 比較ゲノミクス。新たに配列決定されたゲノムと関連する病原体のゲノムを比較して、相違点と類似点を特定します。
• 機能分析: これには、注釈が付けられた遺伝子の機能を特定し、それらが関与する経路とプロセスを理解することが含まれます。 これにより、重要な毒性因子が明らかになり、病原体の発症メカニズムを理解するのに役立ちます。
• 系統解析: これには、新しく配列決定されたゲノムとゲノムの比較が含まれます。
• 関連する病原体を分析して進化的関係を決定し、さまざまな集団での病原体の広がりを追跡します。
• 膀胱がんと健康な人の全体的な微生物組成の違い

• サンプルが評価されます。 NGS は TBRI では利用できません。16S シーケンスとバイオインフォマティクスは、Children Hospital 57357 で有料で行われます (「有料」原則に基づいてシーケンスを実行することは歓迎されます)。

  16S リボソーム RNA (rRNA) 配列解析

  1. 尿および組織からの DNA の分離。 尿検体（50ml）を解凍し、7500g、4℃で10分間遠心分離します。 ペレットは、マイクロバイオーム DNA 精製キットを使用した DNA 抽出に使用されます。 環境汚染を避けるために、尿サンプルおよび試薬のみの抽出コントロールからのすべての分離は PCR フード内で実行されます。 分離された DNA サンプルは、PCR 増幅まで -20 °C に置かれます。 DNA はアッセイキット (Illumina 2013) を使用して定量されます。
  2. PCR ベースの KABA KAPA ライブラリ定量キットには、Illumina プラットフォームでのシーケンシング用に調製された次世代シーケンシング (NGS) ライブラリの正確で信頼性が高く、再現性のある qPCR ベースの定量に必要なすべての試薬が含まれています。 プラットフォーム固有のライブラリ定量プライマープレミックス、および事前希釈された DNA 標準セット。

  16S rRNA 超可変領域 V1V2 および V3-V4 領域は、Illumina アダプターとインデックス バーコードを組み込んだ融合プライマーで増幅されます。

Bioanalyzer システムを使用した高感度 DNA 電気泳動は、NGS ライブラリーの品質管理分析を向上させるために行われます。

3-16S rRNA 遺伝子ライブラリーの調製と MiSeq シーケンス。 16S rRNA の PCR 増幅、配列決定および分析は、V1-V2 および V3-V4 領域をターゲットとする NGS Illumina によって実行されます。 16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンス (16S 解析) は、次世代シーケンス技術による微生物叢の解析に使用されます。 膀胱微生物叢分析プロトコルを最適化するための、標準的な V1-V2、V3-V4 プライマー セットからの 16S 分析データ。

4- バイオインフォマティクスと統計分析。 注釈が付けられたゲノムは、バイオインフォマティック パイプラインを使用してさらに分析され、病原体の生物学と病気を引き起こす可能性についての洞察が得られます。

参考文献

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