Mikrobiota in Urin und Urothel können ein Faktor für die Entstehung von Harnblasenkrebs sein. In der Studie werden Urin- und Blasenkrebsgewebe von männlichen Patienten sowie der Urin von Kontrollpersonen mithilfe von Sequenzierungstechniken für das gesamte Genom und 16S-rRNA untersucht. Ziel ist es, die Rolle von Mikrobiota in der Blase aufzuklären (Cancer bladder)

-Rationalität und Ziele:

A- Blasenkrebs:

Begründung Blasenkrebs ist schätzungsweise die neunthäufigste bösartige Erkrankung mit geschätzten 160.000 oder mehr Todesfällen pro Jahr weltweit.

Es besteht zunehmend ein Bewusstsein für die wichtige Rolle von Mikroben, die im Harntrakt leben und eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Gesundheit und der Entstehung von Krankheiten und Blasenkrebs spielen [1].

Es besteht ein gut etablierter Zusammenhang zwischen der Entstehung von Blasenkrebs und bestimmten mikrobiellen Erregern [2,3,4,5,].

Die Schädigung der Wirts-DNA könnte direkt durch Genotoxine ausgelöst werden, die von bestimmten E. coli-Stämmen produziert werden, oder auf indirektem Weg durch initiierende oxidative Spezies. Mikrobiom und seine Produkte haben eine krebsbekämpfende Wirkung [6].

Traditionell galten Urin und Blasenurothelium bei gesunden Personen als steril. Dieses Konzept basierte auf mikrobiologischen Standardurinkulturen. In jüngster Zeit häufen sich Beweise und Belege dafür, dass auch im Harntrakt bestimmte Kommensal-Mikroorganismen beheimatet sind. Über das Harnmikrobiom wurde bei gesunden Personen berichtet [7].

Das Harnmikrobiom bei Blasenkrebs wurde nur selten untersucht. Es wurde berichtet, dass Streptococcus sp. in der Blase einiger Patienten mit Blasenkrebs angereichert war [8].

Bučević Popović V et al. [1] berichteten: „Bakteriengemeinschaften, die in Urinproben von männlichen Patienten mit Blasenkrebs und von gesunden Personen vorhanden waren, wurden mithilfe der 16S-Sequenzierung analysiert.“ Die Ergebnisse zeigen, dass Firmicutes der am häufigsten vorkommende Stamm in beiden Gruppen war, gefolgt von Actinobacteria, Bacteroidetes und Proteobacteria. Deutlich angereichert im Blasenkrebs war die Gattung Fusobacterium, bei der es sich um einen möglichen protumorigenen Erreger handelt. In Blasenkrebsgeweben waren die durch PCR nachgewiesenen Fusobacterium nucleatum-Sequenzen der Gattungen Veillonella, Streptococcus und Corynebacterium im gesunden Urin häufiger anzutreffen. „Campylobacter hominis wurde in Urinproben von Patienten mit Blasenkrebs angereichert. Campylobacter-Arten sind potenziell pathogen, da sie Toxine produzieren, in Epithelzellen eindringen und Immunreaktionen des Wirts vermeiden können.“

Mikrobiota können beim menschlichen Wirt tumorsuppressive Wirkungen haben [6]. Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS) haben die Profilierung mikrobieller Gemeinschaften in bestimmten Lebensräumen ermöglicht. Die Gensequenzierung der 16S-ribosomalen RNA (rRNA) wird für die Mikrobiota-Profilierung mit NGS-Technologien verwendet. Die Auswahl der zu sequenzierenden hypervariablen 16S-rRNA-Region ist in Mikrobiota-Profilierungsstudien von entscheidender Bedeutung. Alle neun hypervariablen 16S-rRNA-Regionen sind taxonomisch informativ, aber aufgrund der Variabilität der Profilierungsleistung für bestimmte Bereiche hängt die Auswahl der idealen hypervariablen 16S-rRNA-Region jedoch von der Bakterienzusammensetzung des untersuchten Lebensraums ab. Mikrobielle Gemeinschaften, die den Harntrakt besiedeln (das Urobiom), werden in V4, V5 identifiziert. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Urobiom-Dysbiose mit mehreren urologischen Erkrankungen [9,10,11] und Blasenkrebs [12] zusammenhängt.

Ziele: Daher ist es von entscheidender Bedeutung, das Urobiom bei Gesundheit und Blasenkrebs zu charakterisieren, und kann zu neuen Präventions-, Diagnose- und Behandlungsstrategien für Blasenkrebs führen.

Ziele Ziel dieser Forschungsstudie ist es, die Harnmikrobiota erwachsener männlicher Patienten mit Blasenkrebs zu charakterisieren und mit der Mikrobiota gesunder erwachsener männlicher Kontrollpersonen zu korrelieren.

2-Methodik 2-1 Studientyp: Prospektive Fallkontrollstudie 2-2 Einschluss, Ausschlusskriterien, Rekrutierungsprozess. [In die Studie einbezogene Patienten werden gebeten, eine Einverständniserklärung abzugeben, Dr. Loay Mostafa und Dr. Mohamed Sahab von der Urologieabteilung – TBRI werden für diesen Punkt verantwortlich sein].

Einschlusskriterien:

• Erwachsene Männer über 18 Jahre,
• Diagnose eines Blasenkarzinoms mittels bildgebender Ultraschalluntersuchung und/oder Computertomographie sowie Urinzytologie.
• Bestätigter Blasenkrebs entweder während der diagnostischen Zystoskopie, einer früheren Pathologie oder einer pathologischen Untersuchung der Biopsieproben.

Ausschlusskriterien:

• Vorherige Strahlentherapie der Blase oder eines angrenzenden Organs.
• Vorherige intravesikale Instillationsimmuntherapie mit Bacillus Calmette-Guérin (BCG) oder intravesikale Instillation von Chemotherapeutika.
• Vorherige neoadjuvante Chemotherapie. Rekrutierungsprozess Patienten, die die Ausschluss- und Einschlusskriterien erfüllen. 2-3 Stichprobengröße: 38 ägyptische Männer im Alter ≥ 18 Jahre werden in der Abteilung für Urologie, TBRI, gemäß der Stichprobengrößenberechnung unter Verwendung einer Online-Software (Sample Size Calculator) rekrutiert. Von normalen Personen werden zehn Urinproben entnommen.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html Die Stichprobengröße beträgt 16 für nicht-muskelinvasiven Blasenkrebs (NMIBC). Das bedeutet, dass 16 oder mehr Messungen/Umfragen erforderlich sind, um ein Konfidenzniveau von 95 % zu erreichen. Die Stichprobengröße beträgt 11 für muskelinvasiven Blasenkrebs (MIBC). Das bedeutet, dass 40 oder mehr Messungen/Umfragen erforderlich sind, um ein Konfidenzniveau von 95 % zu erreichen. Die Stichprobengröße für die Kontrollgruppe beträgt 11. Das bedeutet, dass 10 oder mehr Messungen/Umfragen erforderlich sind, um ein Konfidenzniveau von 95 % A zu erreichen. 38 Männer werden in der Abteilung für Urologie, TBRI, rekrutiert. Gemäß Stichprobengrößenberechnung mit Online-Software (Sample Size Calculator). Es werden elf Urinproben entnommen. Die Probengröße beträgt 16 für nicht-muskelinvasiven Blasenkrebs (NMIBC). Das bedeutet, dass 16 oder mehr Messungen/Umfragen erforderlich sind, um ein Konfidenzniveau von 95 % zu erreichen, dass der tatsächliche Wert innerhalb von ±17,53 % des gemessenen/erfassten Werts liegt.

Die Stichprobengröße beträgt 11 für muskelinvasiven Blasenkrebs (MIBC). Dies bedeutet, dass 11 oder mehr Messungen/Umfragen erforderlich sind, um ein Konfidenzniveau von 95 % zu erreichen, dass der tatsächliche Wert innerhalb von ±30,36 % des gemessenen/erfassten Werts liegt.

Die Stichprobengröße für die Kontrollgruppe beträgt 11. Dies bedeutet, dass 11 oder mehr Messungen/Umfragen erforderlich sind, um ein Konfidenzniveau von 95 % zu erreichen, dass der tatsächliche Wert innerhalb von ±30,36 % des gemessenen/erfassten Werts liegt.

normale Individuen. Diese Probe repräsentiert die Forschung zum Mikrobiom bei Blasenkrebs.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Probensammlung

Blasenkrebs:

Die Gesamtzahl der untersuchten Proben: Die Studie wird die Mikrobiota im Urin und in Gewebeproben untersuchen, sodass jeder Patient mit Blasenkrebs (2 Proben) abgeben wird. Die Kontrollgruppe wird eine Urinprobe abgeben (eine Probe). Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass Mikrobiota im Urothel von normalen Ungeborenen und Patienten mit Blasenkrebs nachgewiesen werden. Diese Mikrobiota würde sich von der Urin-(Flüssigkeits-)Mikrobiota unterscheiden.

Verweise:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Blasenkrebsbedingte Mikrobiota: Untersuchung von Unterschieden in Urin- und Gewebeproben. Sci Rep. 6. Juli 2020;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilierung der Blasenmikrobiota bei Patienten mit Blasenkrebs. Vordere Mikrobiol. 7. Februar 2022; 12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Gruppe I: Nicht-muskelinvasiver Blasenkrebs, 16 Patienten, 16 für Blasengewebe und 16 für Urinproben. Insgesamt 32 Proben. (Die Studie wird die Mikrobiota im Urin und in Gewebeproben untersuchen, sodass jeder Patient mit Blasenkrebs (2 Proben) abgeben wird. Die Kontrollgruppe wird eine Urinprobe abgeben (eine Probe). Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass Mikrobiota im Urothel von normalen Ungeborenen und Patienten mit Blasenkrebs nachgewiesen werden. Diese Mikrobiota würde sich von der Urin-(Flüssigkeits-)Mikrobiota unterscheiden. (Referenzen:) Gruppe II: Muskelinvasiver Blasenkrebs, 11 Patienten. 22 Proben, 11 für Blasengewebe und 11 für Urinproben, die von denselben Patienten stammen. Gruppe III: 11 normale Erwachsene: Urinproben von dienen als Kontrollgruppe der Studie.

   Die Gesamtzahl der Teilnehmer beträgt 38 Personen.

   Proben zur Mikrobiomanalyse:

   Die Proben werden in sauberen, auslaufsicheren Behältern ohne Desinfektionsmittel- oder Reinigungsmittelrückstände und mit dicht schließenden, auslaufsicheren Deckeln gesammelt und bis zur Analyse im mikrobiologischen Labor des TBRI im Kühlschrank aufbewahrt.

   Während der Zystoskopie-Untersuchung werden Urinproben (50 ml) für die Mikrobiomanalyse entnommen. Die Proben werden bis zur Verarbeitung bei -80 °C gelagert.

   Gewebe- und Urinproben von Patienten mit Blasenkrebs: Im Rahmen des Standardverfahrens der diagnostischen Zystoskopie wird die Urinprobe unter vollständig aseptischen Bedingungen entnommen. Bei Patienten mit Blasentumor wird eine transurethrale Resektion des Blasentumors durchgeführt. Eine Gewebeprobe von 0,5 x 0,5 cm wird untersucht zur Mikrobiomanalyse. Die Proben werden bis zur Verarbeitung bei -80 °C gelagert. Die histopathologische Diagnose mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung wird von einem erfahrenen Pathologen für Tumorgrad und -stadium gemäß WHO 22 und EAU-Richtlinien 2023 durchgeführt. Dieses Verfahren wird sowohl beim nicht muskelinvasiven als auch beim muskelinvasiven Urothelkarzinom angewendet. Patienten, die sich einer radikalen Zystektomie wegen Blasenkrebs unterziehen, werden in die Stichprobengröße einbezogen.

   Proben für pathologische Studien:

   Gewebeproben werden mit Formalin fixiert und mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung untersucht.

   Klinische Informationen Die Urologen stellen ausreichend Gewebeproben zur Verfügung, bei denen es sich um einen kleinen Teil des gesamten resezierten Tumors oder einen Teil der Zystektomieproben handelt. für die pathologische Beurteilung, wobei dem Pathologen nützliche klinische Informationen zur Verfügung gestellt werden, um über den besten Ansatz bei der Handhabung und Verarbeitung der chirurgischen Proben zu entscheiden und einen genauen Pathologiebericht zu erstellen.

   Der Urologe wird Folgendes angeben:

   • Demografische Daten und klinische Vorgeschichte des Patienten, Vorgeschichte von Harnwegsinfektionen und, falls diese wiederkehrend oder sporadisch auftraten, Blasenzytologie, falls vorhanden, ob es sich um das erste Auftreten des Tumors handelt und falls nicht, Einzelheiten zur vorherigen Behandlung.
   • Das zystoskopische Erscheinungsbild der Blasenschleimhaut zeigt Anzahl, Größe, Lage des/der Tumor(s) und die morphologischen Merkmale der Läsion an: papillär, solide oder ulzeriert.
   • Der Zustand der verbleibenden Schleimhaut, wenn weitere Biopsien durchgeführt wurden.

   Diese Informationen sind für eine korrekte Beurteilung des Urothels und die Suche im Mikrobiom notwendig. Denn die Behandlungen können Auswirkungen auf die Tumormorphologie und das normal aussehende Urothel haben.

   Berichterstattung über Blasenkrebsproben

   • Pathologische Beurteilung Der Pathologe diagnostiziert, ob Blasenkrebs vorliegt und um welche Art von Blasenkrebs es sich handelt, indem er Zellen aus der Blasengewebebiopsie untersucht. Gemäß der 2022 geänderten WHO-Klassifikation von Harnblasentumoren aus dem Jahr 2016 (Mazzucchelli et al. 2021) werden verschiedene histologische Tumortypen von Blasenkrebs gemeldet.
   • Mikrobiologische Beurteilung: Methoden zur mikrobiellen Identifizierung aus Urin und Gewebe

   Probenentnahme- und Kulturbedingungen klinischer Bakterienisolate:

   Nachweis einer begrenzten Anzahl von Mikroorganismen, hauptsächlich aerobe und schnell wachsende Bakterien.

   Identifizierung von Bakterienisolaten: Die Isolate werden durch Kultivierung auf Blut, MacConkey-Agar und Sabaruds-Agar identifiziert und anschließend durch Durchführung biochemischer Tests, Oxidase-Tests, Mannitol-, Gallen-Äsculin- und Katalase-Tests identifiziert. Alle Isolate werden mithilfe des Vitek 2-Kompaktsystems auf Artenebene identifiziert.

   2-5 Biochemische und molekularbiologische Bewertung: 16S-Analyse der metagenomischen Sequenzierung Die vollständige genomische Sequenzierung (WGS) wird in allen Fällen angewendet. Methodik und Qualitätskontrolle richten sich nach dem Genom- und Metagenomzentrum im Kinderkrebskrankenhaus 57357, das die durchführen wird WGS- und 16S-Sequenzierung an Urin- und Gewebeproben.

1- DNA-Isolierung aus Urin und Gewebe. Urinproben (50 ml) werden aufgetaut und 10 Minuten lang bei 7500 g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wird für die DNA-Extraktion mit dem Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit verwendet, die gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt wird. Um eine Kontamination der Umwelt zu vermeiden, werden alle Isolierungen aus Urinproben und aus der reinen Reagenz-Extraktionskontrolle in einer PCR-Haube durchgeführt. Isolierte DNA-Proben werden bis zur PCR-Amplifikation bei -20 °C aufbewahrt. Die DNA wird mit dem DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Illumina 2013) quantifiziert.

2- PCR-basierte KABA KAPA-Bibliotheksquantifizierungskits enthalten alle Reagenzien, die für die genaue, zuverlässige und reproduzierbare qPCR-basierte Quantifizierung von Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken (NGS) benötigt werden, die für die Sequenzierung auf Illumina-Plattformen vorbereitet sind. Die Kits umfassen KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formuliert mit verschiedenen passiven Referenzfarbstoffen für verschiedene qPCR-Instrumente), einen plattformspezifischen Primer-Vormix zur Bibliotheksquantifizierung und einen vorverdünnten Satz DNA-Standards.

Die 16S-rRNA-Gen-V3-V4-Region wird mit Fusionsprimern amplifiziert, die Illumina-Adapter und Indexierungsbarcodes enthalten. Der PCR-Schritt fügt Index 1 (i7) und Index 2 (i5), Sequenzierung und gemeinsame Adapter (P5 und P7) hinzu, die für die Clustergenerierung und -sequenzierung erforderlich sind. Zur Verbesserung der Qualitätskontrollanalyse der NGS-Bibliothek wird eine hochempfindliche DNA-Elektrophorese mit dem Bioanalyzer-System durchgeführt. Vorbereitung der 3-16S-rRNA-Genbibliothek und MiSeq-Sequenzierung. Die PCR-Amplifikation der 16S-rDNA, die Sequenzierung und die Analysen werden von NGS Illumina MiSeq durchgeführt, das auf die V3V4-Region des Bakteriums MiSeq Reagent Kit v3 (600 Zyklen) abzielt. Die 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung (16S-Analyse) wird häufig zur Analyse von Mikrobiota mit Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation eingesetzt. 16S-Analysedaten aus den Standard-V3-V4-Primersätzen (V34) zur Optimierung des Blasenmikrobiota-Analyseprotokolls. 4- Bioinformatik und statistische Analysen. Das annotierte Genom wird mithilfe bioinformatischer Pipelines weiter analysiert, um Einblicke in die Biologie des Krankheitserregers und sein Krankheitspotenzial zu gewinnen. Es enthält:

- Qualitätskontrolle und Verbesserung des Entwurfsgenoms durch Beseitigung von Fehlern und Schließung von Lücken.

• Annotation des endgültigen Genoms, einschließlich der Identifizierung und Beschreibung der Funktionen von Genen und anderer Merkmale.
• Vergleichende Genomik, bei der das neu sequenzierte Genom mit denen verwandter Krankheitserreger verglichen wird, um Unterschiede und Ähnlichkeiten zu identifizieren.
• Funktionsanalyse: Dabei geht es darum, die Funktionen der annotierten Gene zu identifizieren und die Wege und Prozesse zu verstehen, an denen sie beteiligt sind. Dies kann wichtige Virulenzfaktoren aufdecken und helfen, den Pathogenesemechanismus des Erregers zu verstehen.
• Phylogenetische Analyse: Dabei handelt es sich um den Vergleich des neu sequenzierten Genoms mit denen von
• verwandte Krankheitserreger, um evolutionäre Beziehungen zu bestimmen und die Ausbreitung von Krankheitserregern in verschiedenen Populationen zu verfolgen.
• Unterschiede in der gesamten mikrobiellen Zusammensetzung zwischen Blasenkrebs und gesunden

• Proben werden ausgewertet. NGS ist in TBRI nicht verfügbar, die 16S-Sequenzierung und Bioinformatik werden im Kinderkrankenhaus 57357 gegen Bezahlung durchgeführt (sie sind herzlich eingeladen, die Sequenzierung nach dem Prinzip „Kostenpflichtig“ durchzuführen).

  16S-ribosomale RNA (rRNA)Sequenzierungsanalyse

  1. DNA-Isolierung aus Urin und Gewebe. Urinproben (50 ml) werden aufgetaut und 10 Minuten lang bei 7500 g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wird zur DNA-Extraktion mit dem Mikrobiom-DNA-Reinigungskit verwendet. Um eine Kontamination der Umwelt zu vermeiden, werden alle Isolierungen aus Urinproben und aus der reinen Reagenz-Extraktionskontrolle in einer PCR-Haube durchgeführt. Isolierte DNA-Proben werden bis zur PCR-Amplifikation bei -20 °C gelagert. Die DNA wird mithilfe eines Assay-Kits quantifiziert (Illumina 2013).
  2. PCR-basierte KABA KAPA-Bibliotheksquantifizierungskits enthalten alle Reagenzien, die für die genaue, zuverlässige und reproduzierbare qPCR-basierte Quantifizierung von Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken (NGS) benötigt werden, die für die Sequenzierung auf Illumina-Plattformen vorbereitet sind. Eine plattformspezifische Primer-Vormischung zur Bibliotheksquantifizierung und ein vorverdünnter Satz DNA-Standards.

  Die hypervariablen 16S-rRNA-Regionen V1, V2 und V3-V4 werden mit Fusionsprimern amplifiziert, die Illumina-Adapter und Indexierungsbarcodes enthalten.

Zur Verbesserung der Qualitätskontrollanalyse der NGS-Bibliothek wird eine hochempfindliche DNA-Elektrophorese mit dem Bioanalyzer-System durchgeführt.

Vorbereitung der 3-16S-rRNA-Genbibliothek und MiSeq-Sequenzierung. Die PCR-Amplifikation der 16S-rRNA, die Sequenzierung und die Analysen werden von NGS Illumina durchgeführt und zielen auf die Regionen V1-V2 und V3-V4 ab. Die 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung (16S-Analyse) wird zur Analyse von Mikrobiota mit Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation verwendet. 16S-Analysedaten aus den Standard-Primersätzen V1-V2 und V3-V4 zur Optimierung des Blasenmikrobiota-Analyseprotokolls.

4- Bioinformatik und statistische Analysen. Das annotierte Genom wird mithilfe bioinformatischer Pipelines weiter analysiert, um Einblicke in die Biologie des Krankheitserregers und sein Krankheitspotenzial zu gewinnen.

Verweise

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