Микробиота в моче и уротелии может быть фактором индукции рака мочевого пузыря. В ходе исследования будут изучены ткани рака мочи и мочевого пузыря у пациентов мужского пола, а также моча контрольной группы с использованием методов полногеномного секвенирования и 16S рРНК. Цель — выяснить роль микробиоты в мочевом пузыре. (Cancer bladder)

-Обоснование и цели:

А- Рак мочевого пузыря:

Обоснование Рак мочевого пузыря, по оценкам, является девятым наиболее частым злокачественным заболеванием, от которого по оценкам во всем мире умирает 160 000 или более случаев в год.

Все больше осознается важная роль микробов, обитающих в мочевыводящих путях и играющих важную роль в поддержании здоровья и развитии заболеваний и рака мочевого пузыря [1].

Существует хорошо установленная корреляция между возникновением рака мочевого пузыря и специфическими микробными агентами [2,3,4,5].

Повреждение ДНК хозяина может быть инициировано непосредственно генотоксинами, продуцируемыми конкретными штаммами E. coli, или косвенным путем, инициируя окислительные виды. Микробиом и его продукты оказывают противораковое действие [6].

Традиционно у здоровых людей уротелий мочи и мочевого пузыря считается стерильным. Эта концепция была основана на стандартных микробиологических посевах мочи. В последнее время появляется все больше доказательств того, что мочевыводящие пути также содержат различные комменсальные микроорганизмы. Сообщалось о микробиоме мочи у здоровых людей [7].

Микробиом мочи при раке мочевого пузыря исследовался нечасто, сообщалось, что Streptococcus sp был обогащен в мочевом пузыре некоторых пациентов с раком мочевого пузыря [8].

Бучевич Попович В. и др. [1] сообщили, что: «Бактериальные сообщества, присутствующие в образцах мочи пациентов мужского пола с раком мочевого пузыря и здоровых людей, были проанализированы с использованием секвенирования 16S. Результаты показывают, что наиболее распространенным типом в обеих группах были Firmicutes, за которыми следовали Actinobacteria, Bacteroidetes и Proteobacteria. Значительно обогатился рак мочевого пузыря родом Fusobacterium, который является возможным протуморогенным возбудителем. В тканях рака мочевого пузыря последовательности Fusobacterium nucleatum, обнаруженные с помощью ПЦР, родов Veillonella, Streptococcus и Corynebacterium, были более распространены в здоровой моче. Campylobacter hominis был обнаружен в образцах мочи пациентов с раком мочевого пузыря. Виды Campylobacter потенциально патогенны, поскольку они производят токсины, проникают в эпителиальные клетки и могут избежать иммунных реакций хозяина».

Микробиота может оказывать опухолесупрессирующее действие на человека-хозяина [6]. Технологии секвенирования нового поколения (NGS) позволили составить профили микробных сообществ в конкретных средах обитания. Секвенирование гена 16S рибосомальной РНК (рРНК) используется для профилирования микробиоты с помощью технологий NGS. Выбор гипервариабельной области 16S рРНК для секвенирования имеет решающее значение в исследованиях профиля микробиоты. Все девять гипервариабельных областей 16S рРНК таксономически информативны, но из-за вариабельности характеристик профилирования конкретно выбор идеальной гипервариабельной области 16S рРНК будет зависеть от бактериального состава изучаемой среды обитания. Микробные сообщества, колонизирующие мочевыводящие пути (уробиом), идентифицируются в V4, V5. Недавние исследования показали, что дисбиоз уробиома связан с несколькими урологическими заболеваниями [9,10,11] и раком мочевого пузыря [12].

Цели: Таким образом, крайне важно охарактеризовать уробиом в здравоохранении и раке мочевого пузыря, что может привести к разработке новых стратегий профилактики, диагностики и лечения рака мочевого пузыря.

Цели. Целью данного исследования является характеристика микробиоты мочи взрослых мужчин, больных раком мочевого пузыря, и ее корреляция с микробиотой здоровых взрослых мужчин из контрольной группы.

2-Методология 2-1 Тип исследования: Проспективное исследование случай-контроль 2-2 Включение, критерии исключения, процесс набора. [пациентам, включенным в исследование, будет предложено дать информированное согласие, за этот вопрос будут отвечать д-р Лоай Мостафа и д-р Мохамед Сахаб из отделения урологии - TBRI].

Критерии включения:

• Взрослые мужчины старше 18 лет,
• Диагностирован рак мочевого пузыря с помощью ультразвукового исследования и/или компьютерной томографии, а также цитологического исследования мочи.
• Подтвержденный рак мочевого пузыря либо во время диагностической цистоскопии, предшествующей патологии или патологического исследования образцов биопсии.

Критерий исключения:

• Предыдущая лучевая терапия мочевого пузыря или соседнего органа.
• Предыдущая внутрипузырная инстилляция иммунотерапии бациллой Кальметта-Герена (БЦЖ) или внутрипузырная инстилляция химиотерапевтических препаратов.
• Предыдущая неоадъювантная химиотерапия. Процесс набора пациентов Пациенты, соответствующие критериям исключения и включения. 2-3 Размер выборки Тридцать восемь египетских мужчин в возрасте ≥ 18 лет будут набраны в отделении урологии TBRI в соответствии с расчетом размера выборки с использованием онлайн-программы (калькулятор размера выборки). Десять образцов мочи будут собраны у здоровых людей.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html Размер выборки составит 16 человек для немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря (NMIBC). Это означает, что для достижения уровня достоверности 95 % необходимо 16 или более измерений/обследований. Размер выборки составит 11 человек для мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря (MIBC). Это означает, что для достижения уровня достоверности 95% необходимо 40 или более измерений/обследований. Размер выборки составит 11 человек для контрольной группы. Это означает, что для достижения уровня достоверности 95% A необходимо провести 10 или более измерений/обследований. 38 мужчин будут набраны в отделение урологии TBRI. Согласно расчету размера выборки с использованием онлайн-программы (Калькулятор размера выборки). Будет собрано одиннадцать образцов мочи из 16 образцов для немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря (NMIBC). Это означает, что необходимо 16 или более измерений/обследований, чтобы иметь уровень уверенности 95 % в том, что реальное значение находится в пределах ±17,53 % от измеренного/обследованного значения.

Размер выборки составит 11 человек для мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря (MIBC). Это означает, что необходимо 11 или более измерений/обследований, чтобы иметь уровень уверенности 95 % в том, что реальное значение находится в пределах ±30,36 % от измеренного/обследованного значения.

Размер выборки составит 11 человек для контрольной группы. Это означает, что необходимо 11 или более измерений/обследований, чтобы иметь уровень уверенности 95 % в том, что реальное значение находится в пределах ±30,36 % от измеренного/обследованного значения.

нормальные личности. Этот образец представляет собой исследование микробиома при раке мочевого пузыря.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Сбор проб

Рак мочевого пузыря:

Общее количество исследуемых образцов: В ходе исследования будет изучена микробиота в моче и образцах тканей, поэтому каждый пациент с раком мочевого пузыря предоставит (2 образца). Контрольная группа сдаст образец мочи (один образец). Недавние исследования показали, что микробиота обнаруживается в уротелии нормальных людей и пациентов с раком мочевого пузыря, эта микробиота будет отличаться от микробиоты мочи (жидкости).

Использованная литература:

1. Мансур Б., Моньок А., Макра Н., Гайдач М., Ваднай И., Лигети Б., Юхас Дж., Сабо Д., Осторхази Э. Микробиота, связанная с раком мочевого пузыря: изучение различий в образцах мочи и тканей. Sci Rep. 6 июля 2020 г.; 10 (1): 11042. дои: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Парра-Гранде М., Оре-Арсе М., Мартинес-Приего Л., Д'Аурия Г., Росселло-Мора Р., Лилло М., Семпере А., Лумбрерас Б., Санчес-Хеллин В. Профилирование микробиоты мочевого пузыря у пациентов с раком мочевого пузыря. Передняя микробиол. 2022, 7 февраля; 12: 718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Группа I: неинвазивный рак мочевого пузыря, 16 пациентов, 16 для тканей мочевого пузыря и 16 для образцов мочи. Всего 32 образца. (В ходе исследования будет изучена микробиота в моче и образцах тканей, поэтому каждый пациент с раком мочевого пузыря предоставит (2 образца). Контрольная группа сдаст образец мочи (один образец). Недавние исследования показали, что микробиота обнаруживается в уротелии нормальных людей и пациентов с раком мочевого пузыря, эта микробиота будет отличаться от микробиоты мочи (жидкости). (Ссылки:) Группа II: мышечный инвазивный рак мочевого пузыря, 11 пациентов. 22 пробы: 11 для ткани мочевого пузыря и 11 для мочи, полученные от одних и тех же пациентов. Группа III: 11 нормальных взрослых: образцы мочи служат контрольной группой исследования.

   Общее количество участников – 38 человек.

   Образцы для анализа микробиома:

   Пробы будут собираться в чистые герметичные контейнеры без остатков дезинфицирующих и моющих средств, с плотно закрывающимися герметичными крышками и храниться в холодильнике до анализа в микробиологической лаборатории ТБРИ.

   Образцы мочи (50 мл) для анализа микробиома будут собраны во время цистоскопического исследования. Образцы будут храниться при температуре -80 °C до обработки.

   Образцы тканей и мочи пациентов с раком мочевого пузыря: В рамках стандартной процедуры диагностической цистоскопии образец мочи будет собран в полных асептических условиях, пациентам с опухолью мочевого пузыря будет проведена трансуретральная резекция опухоли мочевого пузыря, будет исследован образец ткани размером 0,5х0,5 см. для анализа микробиома. Образцы будут храниться при температуре -80 °C до обработки. Гистопатологический диагноз с помощью окраски гематоксилином и эозином будет проводиться экспертом-патологом в зависимости от степени и стадии опухоли в соответствии с рекомендациями ВОЗ 22 и EAU 2023. Эта процедура будет применяться как при немышечно-инвазивной, так и при мышечно-инвазивной уротелиальной карциноме. Пациенты, которым предстоит радикальная цистэктомия по поводу рака мочевого пузыря, будут включены в размер выборки.

   Образцы для патологоанатомических исследований:

   Образцы тканей фиксируют формалином и исследуют с помощью окраски гематоксилином и эозином.

   Клиническая информация Урологи предоставят адекватные образцы тканей, которые представляют собой небольшую часть всей удаленной опухоли или часть образцов цистэктомии. для патологоанатомической оценки с предоставлением патологоанатому полезной клинической информации для принятия решения о наилучшем подходе к обращению и обработке хирургических образцов и составления точного отчета о патологии.

   Уролог уточнит:

   • Демографические данные и клинический анамнез пациента, история инфекции мочевыводящих путей и, если она была рецидивирующей или спорадической, цитология мочевого пузыря, если она присутствует, является ли это первым проявлением опухоли, а если нет, подробности предыдущего лечения.
   • При цистоскопии слизистую оболочку мочевого пузыря определяют количество, размер, локализацию опухоли/ов, морфологические особенности поражения: папиллярное, солидное или изъязвленное.
   • Состояние оставшейся слизистой оболочки при проведении дальнейших биопсий.

   Эти сведения необходимы для правильной оценки уротелия и поиска в микробиоме. Потому что лечение может повлиять на морфологию опухоли и на нормально выглядящий уротелий.

   Отчетность об образцах рака мочевого пузыря

   • Патологоанатомическая оценка Патологоанатом диагностирует наличие рака мочевого пузыря и его тип, исследуя клетки биопсии ткани мочевого пузыря. О различных гистологических типах опухолей мочевого пузыря будет сообщено в соответствии с классификацией опухолей мочевого пузыря ВОЗ 2016 г. (Mazzucchelli et al. 2021), измененной в 2022 г.
   • Микробиологическая оценка: методы идентификации микробов в моче и тканях.

   Отбор проб и условия культивирования клинических бактериальных изолятов:

   Обнаружение ограниченного числа микроорганизмов, преимущественно аэробных и быстрорастущих бактерий.

   Идентификация бактериальных изолятов: Изоляты будут идентифицированы путем культивирования на крови, агаре МакКонки и агаре Сабарудса, затем будут идентифицированы с помощью биохимических тестов, маннитола, оксидазного теста, желчного эскулина и каталазного теста. Все изоляты будут идентифицированы до видового уровня с помощью компактной системы Vitek 2.

   2-5 Оценка биохимии и молекулярной биологии: анализ метагеномного секвенирования 16S. Во всех случаях будет применяться полногеномное секвенирование (WGS), методология и контроль качества осуществляются в соответствии с геномным и метагеномным центром детской онкологической больницы 57357, который будет выполнять Секвенирование WGS и 16S в образцах мочи и тканей.

1- Выделение ДНК из мочи и тканей. Образцы мочи (50 мл) размораживают и центрифугируют при 7500 g, 4°C в течение 10 минут. Осадок будет использоваться для экстракции ДНК с использованием набора для очистки ДНК микробиома Invitrogen™ PureLink™, выполняемой в соответствии с протоколом производителя. Во избежание загрязнения окружающей среды все выделения из образцов мочи и из контрольной экстракции, состоящей только из реагентов, будут проводиться в шкафу для ПЦР. Изолированные образцы ДНК будут помещены при -20 ° C до амплификации ПЦР. ДНК будет количественно оценена с использованием набора для высокочувствительного анализа DeNovix dsDNA (Illumina 2013).

2. Наборы для количественного анализа библиотеки KABA KAPA на основе ПЦР содержат все реагенты, необходимые для точного, надежного и воспроизводимого количественного анализа на основе кПЦР библиотек секвенирования нового поколения (NGS), подготовленных для секвенирования на платформах Illumina. Наборы включают KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (в состав которого входят различные пассивные эталонные красители для разных инструментов qPCR), премикс праймеров для количественного анализа для конкретной платформы и предварительно разведенный набор стандартов ДНК.

Область V3-V4 гена 16S рРНК будет амплифицирована с помощью праймеров слияния, которые включают адаптеры Illumina и индексирующие штрих-коды. На этапе ПЦР добавляются индекс 1 (i7) и индекс 2 (i5), секвенирование и общие адаптеры (P5 и P7), необходимые для создания кластеров и секвенирования. Для улучшения контроля качества анализа библиотеки NGS будет проведен высокочувствительный электрофорез ДНК с использованием системы Bioanalyzer. Подготовка библиотеки генов 3-16S рРНК и секвенирование MiSeq. ПЦР-амплификация 16S рДНК, секвенирование и анализ будут выполняться с помощью NGS Illumina MiSeq, нацеленного на область V3V4 бактерий MiSeq Reagent Kit v3 (600 циклов). Секвенирование ампликона гена 16S рРНК (анализ 16S) широко используется для анализа микробиоты с помощью технологий секвенирования нового поколения. Данные анализа 16S из стандартных наборов праймеров V3-V4 (V34) для оптимизации протокола анализа микробиоты мочевого пузыря. 4- Биоинформатика и статистический анализ. Аннотированный геном далее анализируется с использованием биоинформационных конвейеров, чтобы получить представление о биологии патогена и его потенциальной способности вызывать заболевание. Оно включает:

- Контроль качества и доработка проекта генома путем устранения ошибок и заполнения пробелов.

• Аннотация окончательного генома, включая определение и описание функций генов и других особенностей.
• Сравнительная геномика, которая включает сравнение недавно секвенированного генома с геномом родственных патогенов для выявления различий и сходств.
• Функциональный анализ: включает в себя определение функций аннотированных генов и понимание путей и процессов, в которых они участвуют. Это может выявить ключевые факторы вирулентности и помочь понять механизм патогенеза возбудителя.
• Филогенетический анализ. Он включает в себя сравнение вновь секвенированного генома с геномом другого человека.
• родственных патогенов для определения эволюционных связей и отслеживания распространения патогенов в разных популяциях.
• Различия в общем микробном составе между раком мочевого пузыря и здоровыми

• образцы будут оценены. НГС в ТБРИ отсутствует, секвенирование 16S и биоинформатика будут проводиться платно в ДГБ 57357 (приглашаются к выполнению секвенирования по принципу «Платно»).

  16S рибосомальная РНК (рРНК) Анализ секвенирования

  1. Выделение ДНК из мочи и тканей. Образцы мочи (50 мл) размораживают и центрифугируют при 7500 g, 4°C в течение 10 минут. Осадок будет использоваться для экстракции ДНК с использованием набора для очистки ДНК микробиома. Во избежание загрязнения окружающей среды все выделения из образцов мочи и из контрольной экстракции, состоящей только из реагентов, будут проводиться в шкафу для ПЦР. Изолированные образцы ДНК будут помещены при -20 ° C до ПЦР-амплификации. ДНК будет количественно оценена с использованием набора для анализа (Illumina 2013).
  2. Наборы для количественного анализа библиотеки KABA KAPA на основе ПЦР содержат все реагенты, необходимые для точного, надежного и воспроизводимого количественного анализа на основе кПЦР библиотек секвенирования нового поколения (NGS), подготовленных для секвенирования на платформах Illumina. Премикс праймеров для количественного определения библиотеки, ориентированный на конкретную платформу, и предварительно разведенный набор стандартов ДНК.

  Гипервариабельные области 16S рРНК V1V2 и V3-V4 будут амплифицированы с помощью праймеров слияния, которые включают адаптеры Illumina и индексирующие штрих-коды.

Для улучшения контроля качества анализа библиотеки NGS будет проведен высокочувствительный электрофорез ДНК с использованием системы Bioanalyzer.

Подготовка библиотеки генов 3-16S рРНК и секвенирование MiSeq. ПЦР-амплификация 16S рРНК, секвенирование и анализ будут выполнены с помощью NGS Illumina, нацеленного на области V1-V2 и V3-V4. Секвенирование ампликона гена 16S рРНК (анализ 16S) будет использоваться для анализа микробиоты с помощью технологий секвенирования следующего поколения. Данные анализа 16S из стандартных наборов праймеров V1-V2, V3-V4 для оптимизации протокола анализа микробиоты мочевого пузыря.

4- Биоинформатика и статистический анализ. Аннотированный геном далее анализируется с использованием биоинформационных конвейеров, чтобы получить представление о биологии патогена и его потенциальной способности вызывать заболевание.

Рекомендации

1. Бучевич Попович В, Шитум М, Чоу КТ, Чан Л.С., Ройе Б, Терзич Дж. Микробиом мочи, связанный с раком мочевого пузыря. Sci Rep. 14 августа 2018 г.; 8 (1): 12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Вишахи М., Отто Т. и Голка К. Ре: карциномы мочевого пузыря у пациентов с нейрогенным мочевым пузырем и шистосомозом мочевых путей – одни и те же опухоли? Мировой журнал J Urol 40, 2139–2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Ханан Р., Мурата М., Ма Н., Хаммам О., Вишахи М., Эль Лейти Т., Хираку Ю., Оикава С., Каваниши С. (2012)Ядерная локализация ЦОГ-2 в связи с экспрессией маркеров стволовости при раке мочевого пузыря. Медиат Инфламм 2012:165879 2012;2012:165879. дои: 10.1155/2012/165879.
4. Канкрини Ф., Мишель Ф., Куссено О., Альшехи Х., Комперат Е., Фе V (2022)Карциномы мочевого пузыря у пациентов с нейрогенным мочевым пузырем и мочевым шистосомозом: одни и те же опухоли? Мировой Джей Урол. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Хаммам О, Вишахи М, Халил Х, Эль Ганзури Х, Бадави М, Эльхкули А, Элесайли К (2014)Экспрессия цитокератина 7, 20, 14 при уротелиальной карциноме и плоскоклеточном раке египетского рака мочевого пузыря. J Египет Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Зитвогель Л., Дайер Р., Роберти М.П., ​​Рути Б., Кремер Г. Противораковые эффекты микробиома и его продуктов. Нат. Преподобный Микробиол. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Уайтсайд С.А., Разви Х., Дэйв С., Рид Дж., Бертон Дж.П. Микробиом мочевыводящих путей – роль, выходящая за рамки инфекции. Нат. Преподобный Урол. 2015;12:81-90. дои: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Сюй В и др. Мини-обзор: взгляд на микробиом в патогенезе уротелиальной карциномы. Являюсь. Дж. Клин. Эксп. Урол. 2014;2:57-61.
9. Брубейкер Л., Гурдин Ж.-П. Ф., Сиддики, Нью-Йорк, Холланд, А., Халверсон, Т., Лимерия, Р. и др. (2021а). Формирование консенсуса для продвижения исследований уробиома. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Брубейкер Л., Путонти К., Донг К. и Вулф А.Дж. (2021b). Уробиом человека. Мамм. Геном 32, 232-238. дои: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Карраско В., Сориано-Лерма А., Сориано М. Дж. и Гарсия-Сальседо Дж. А. (2021). Мочевой микробиом: Инь и Ян мочевыводящих путей. Передний. Клетка. Заразить. Микробиол. 11. дои: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43. Ву Н и др. Признаки дисбиоза фекальной микробиоты у больных колоректальным раком. Микроб. Экол. 2013;66:462-470. дои: 10.1007/s00248-013-0245-9.