Microbiota in urine en urotheel kunnen een factor zijn voor de inductie van urineblaaskanker. De studie zal urine- en blaaskankerweefsels van mannelijke patiënten en de urine van controles onderzoeken met behulp van Whole Genomic Sequencing-technieken en 16S-rRNA. Het doel is om de rol van microbiota in de blaas op te helderen (Cancer bladder)

-Rationeel en doelstellingen:

A- Blaaskanker:

Achtergrond Blaaskanker is naar schatting de negende meest voorkomende kwaadaardige ziekte, met naar schatting 160.000 of meer sterfgevallen per jaar wereldwijd.

Er is een toenemend bewustzijn van de belangrijke rol van microben die in de urinewegen leven en die een belangrijke rol spelen bij het behoud van de gezondheid en de ontwikkeling van ziekten en blaaskanker [1].

Er bestaat een gevestigde correlatie tussen het ontstaan ​​van blaaskanker en specifieke microbiële agentia [2,3,4,5,].

Schade aan het gastheer-DNA zou direct kunnen worden geïnitieerd via genotoxinen geproduceerd door specifieke E. coli-stammen of via een indirecte route door oxidatieve soorten te initiëren. Microbiome en zijn producten hebben een kankerbestrijdende werking [6].

Traditioneel worden urine- en blaasurothelium bij gezonde personen als steriel beschouwd. Dit concept was gebaseerd op standaard microbiologische urineculturen. Onlangs zijn er steeds meer bewijzen en aanwijzingen dat de urinewegen ook verschillende commensale micro-organismen herbergen. Het urinemicrobioom is gerapporteerd bij gezonde individuen [7].

Het urinemicrobioom bij blaaskanker is zelden onderzocht; er werd gemeld dat Streptococcus sp verrijkt was in de blaas van sommige patiënten met blaaskanker [8].

Bučević Popović V et al [1] rapporteerden dat: "Bacteriële gemeenschappen aanwezig in urinespecimens van mannelijke patiënten met blaaskanker en van gezonde individuen werden geanalyseerd met behulp van 16S-sequencing. De resultaten laten zien dat Firmicutes de meest voorkomende phylum in beide groepen was, gevolgd door Actinobacteria, Bacteroidetes en Proteobacteria. Aanzienlijk verrijkt op het gebied van blaaskanker was het geslacht Fusobacterium, een mogelijk protumorigeen pathogeen. In blaaskankerweefsels waren Fusobacterium nucleatum-sequenties gedetecteerd door PCR, de geslachten Veillonella, Streptococcus en Corynebacterium, overvloediger aanwezig in gezonde urine. Campylobacter hominis werd verrijkt in urinemonsters van patiënten met blaaskanker. Campylobacter-soorten zijn potentieel pathogeen omdat ze toxines produceren, epitheelcellen binnendringen en immuunreacties van de gastheer kunnen vermijden.

Microbiota kunnen tumoronderdrukkende effecten hebben op de menselijke gastheer [6]. Next-generation sequencing (NGS)-technologieën hebben de profilering van microbiële gemeenschappen in specifieke habitats mogelijk gemaakt. 16S ribosomaal RNA (rRNA) gensequencing wordt gebruikt voor microbiota-profilering met NGS-technologieën. Het kiezen van welk 16S rRNA-hypervariabele gebied moet worden gesequenced is van cruciaal belang bij microbiota-profileringsstudies. Alle negen 16S rRNA hypervariabele regio's zijn taxonomisch informatief, maar vanwege de variabiliteit in de profileringsprestaties zal het kiezen van de ideale 16S rRNA hypervariabele regio afhangen van de bacteriële samenstelling van de onderzochte habitat. Microbiële gemeenschappen die de urinewegen koloniseren (het urobioom) worden geïdentificeerd in V4,V5. Recente onderzoeken hebben aangetoond dat urobioomdysbiose verband houdt met verschillende urologische aandoeningen [9,10,11] en blaaskanker [12].

Doelstellingen: Daarom is het van cruciaal belang om het urobioom in de gezondheidszorg en blaaskanker te karakteriseren, en dit kan leiden tot nieuwe preventie-, diagnose- en behandelingsstrategieën voor blaaskanker.

Doelstellingen Het doel van dit onderzoek is om de urinemicrobiota van volwassen mannelijke patiënten met blaaskanker te karakteriseren en te correleren met de microbiota van gezonde volwassen mannelijke controlepersonen.

2-Methodologie 2-1 Studietype: Prospectief case-controlonderzoek 2-2 Inclusie, exclusiecriteria, rekruteringsproces. [Aangenomen patiënten in de studie zullen worden gevraagd om geïnformeerde toestemming te geven; Dr. Loay Mostafa en Dr. Mohamed Sahab van de afdeling Urologie - TBRI zullen verantwoordelijk zijn voor dit item.]

Inclusiecriteria:

• Volwassen mannen ouder dan 18 jaar,
• Gediagnosticeerd met blaascarcinoom met beeldvormende echografie en/of computertomografie en urinecytologie.
• Bevestigde blaaskanker tijdens diagnostische cystoscopie, eerdere pathologie of pathologisch onderzoek van de biopsiespecimens.

Uitsluitingscriteria:

• Eerdere radiotherapie van de blaas of een aangrenzend orgaan.
• Eerdere intravesicale instillatie-immunotherapie met Bacillus Calmette-Guérin (BCG), of intravesicale instillatie van chemotherapeutica.
• Eerdere neoadjuvante chemotherapie. Rekruteringsproces Patiënten die voldoen aan de uitsluitings- en inclusiecriteria. 2-3 Steekproefomvang Achtendertig Egyptische mannen, leeftijd ≥ 18 jaar, zullen worden gerekruteerd bij de afdeling Urologie, TBRI, op basis van de berekening van de steekproefomvang met behulp van online software (Sample Size Calculator). Er zullen tien urinemonsters worden verzameld van normale personen.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html De steekproefomvang voor niet-spierinvasieve blaaskanker (NMIBC) zal 16 bedragen. Dit betekent dat er 16 of meer metingen/enquêtes nodig zijn om een ​​betrouwbaarheidsniveau van 95% te bereiken. De steekproefomvang voor spierinvasieve blaaskanker (MIBC) zal 11 bedragen. Dit betekent dat er 40 of meer metingen/enquêtes nodig zijn om een ​​betrouwbaarheidsniveau van 95% te bereiken. De steekproefomvang voor de controlegroep zal 11 zijn. Dit betekent dat er 10 of meer metingen/enquêtes nodig zijn om een ​​betrouwbaarheidsniveau van 95% A te bereiken. Er zullen 38 mannen worden gerekruteerd bij de afdeling Urologie, TBRI. Volgens berekening van de steekproefomvang met behulp van online software (Sample Size Calculator). Er zullen elf urinemonsters worden verzameld. De steekproefgrootte zal 16 zijn voor niet-spierinvasieve blaaskanker (NMIBC). Dit betekent dat er 16 of meer metingen/enquêtes nodig zijn om een ​​betrouwbaarheidsniveau van 95% te bereiken dat de werkelijke waarde binnen ±17,53% van de gemeten/onderzochte waarde ligt.

De steekproefomvang voor spierinvasieve blaaskanker (MIBC) zal 11 bedragen. Dit betekent dat er 11 of meer metingen/enquêtes nodig zijn om een ​​betrouwbaarheidsniveau van 95% te bereiken dat de werkelijke waarde binnen ±30,36% van de gemeten/onderzochte waarde ligt.

De steekproefomvang voor de controlegroep zal 11 zijn. Dit betekent dat er 11 of meer metingen/enquêtes nodig zijn om een ​​betrouwbaarheidsniveau van 95% te bereiken dat de werkelijke waarde binnen ±30,36% van de gemeten/onderzochte waarde ligt.

normale individuen. Dit monster vertegenwoordigt het onderzoek naar het microbioom bij blaaskanker.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Monsterverzameling

Blaaskanker:

Het totaal aantal bestudeerde monsters: Het onderzoek zal de microbiota in urine en in weefselmonsters onderzoeken, zodat elke patiënt met blaaskanker (2 monsters) zal geven. De controlegroep geeft urinemonster (één samble). Recent onderzoek heeft aangetoond dat microbiota worden aangetroffen in het urotheel van normale individuen en patiënten met blaaskanker. Deze microbiota zou verschillen van urine (vloeibare) microbiota.

Referenties:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Blaaskanker-gerelateerde microbiota: onderzoek naar verschillen in urine- en weefselmonsters. Sci Rep. 2020 6 juli;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilering van de blaasmicrobiota bij patiënten met blaaskanker. Voorste microbiol. 7 februari 2022;12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Groep I: Niet-spierinvasieve blaaskanker, 16 patiënten, 16 voor blaasweefsel en 16 voor urinemonsters. Totaal 32 monsters. (De studie zal de microbiota in urine en in weefselmonsters onderzoeken, zodat elke patiënt met blaaskanker (2 monsters) zal geven. De controlegroep geeft urinemonster (één samble). Recent onderzoek heeft aangetoond dat microbiota worden aangetroffen in het urotheel van normale individuen en patiënten met blaaskanker. Deze microbiota zou verschillen van de urine(vloeibare) microbiota. (Referenties: ) Groep II: Spierinvasieve blaaskanker, 11 patiënten. 22 monsters, waarvan 11 voor blaasweefsel en 11 voor urinemonsters verkregen van dezelfde patiënten. Groep III: 11 normale volwassenen: urinemonsters dienen als controlegroep van het onderzoek.

   Het totale aantal deelnemers is 38 personen.

   Monsters voor microbioomanalyse:

   Monsters worden verzameld in schone lekvrije containers zonder resten van desinfectiemiddel of wasmiddel en met goed sluitende lekvrije deksels en bewaard in een koelkast totdat ze worden geanalyseerd in het microbiologisch laboratorium van TBRI.

   Urinemonsters (50 ml) voor microbioomanalyse worden verzameld tijdens cystoscopieonderzoek. Monsters worden tot verwerking bij -80 °C bewaard.

   Weefsel- en urinemonsters van patiënten met blaaskanker: onder standaardprocedure van diagnostische cystoscopie wordt urinemonster verzameld onder volledig aseptische omstandigheden, patiënten met blaastumor ondergaan transurethrale resectie van blaastumor, een weefselmonster van 0,5x0,5 cm wordt onderzocht voor microbioomanalyse. Monsters worden tot verwerking bij -80 °C bewaard. Histopathologische diagnose met hematoxyline- en eosinekleuring zal worden uitgevoerd door een deskundige patholoog voor de graad en het stadium van de tumor volgens WHO 22 en EAU-richtlijnen 2023. Deze procedure zal worden toegepast voor zowel niet-spierinvasief als spierinvasief urotheelcarcinoom. Patiënten die een radicale cystectomie voor blaaskanker zullen ondergaan, zullen in de steekproefomvang worden opgenomen.

   Monsters voor pathologische onderzoeken:

   Weefselmonsters worden gefixeerd met formaline en onderzocht met hematoxyline- en eosinekleuring.

   Klinische informatie De urologen zullen adequate weefselmonsters verstrekken die een klein deel vormen van de gehele gereseceerde tumor of een deel van cystectomiespecimens. voor pathologische evaluatie met het verstrekken van nuttige klinische informatie aan de patholoog om te beslissen over de beste aanpak bij het hanteren en verwerken van de chirurgische monsters en het opstellen van een nauwkeurig pathologierapport.

   De uroloog zal specificeren:

   • Demografische gegevens en klinische geschiedenis van de patiënt, geschiedenis van urineweginfectie en of deze recidiverend of sporadisch was, blaascytologie indien aanwezig, of het de eerste presentatie van de tumor is en zo niet, details van eerdere behandeling.
   • Het cystoscopische uiterlijk van het blaasslijmvlies en geeft het aantal, de grootte, de locatie van de tumor(en) en de morfologische kenmerken van de laesie aan: papillair, vast of zwerend.
   • De toestand van het resterende slijmvlies als verdere biopsieën zouden worden uitgevoerd.

   Deze informatie is nodig voor een correcte evaluatie van urotheel en zoeken in het microbioom. Omdat de behandelingen een impact kunnen hebben op de tumormorfologie en op het normaal uitziende urotheel.

   Rapportage van blaaskankermonsters

   • Pathologische beoordeling De patholoog stelt vast of er sprake is van blaaskanker en wat voor soort blaaskanker dat is, door cellen uit het blaasweefselbiopsie te onderzoeken. Er zullen verschillende histologische tumortypes van blaaskanker worden gerapporteerd volgens de WHO-classificatie van urineblaastumoren uit 2016 (Mazzucchelli et al. 2021), aangepast in 2022.
   • Microbiologische beoordeling: Microbiële identificatiemethoden uit urine en weefsel

   Monstername- en kweekomstandigheden van klinische bacteriële isolaten:

   Detectie van een beperkt aantal micro-organismen, voornamelijk aerobe en snelgroeiende bacteriën.

   Identificatie van bacteriële isolaten: De isolaten zullen worden geïdentificeerd door het kweken op bloed, MacConkey-agar en sabaruds-agar en vervolgens worden geïdentificeerd door het uitvoeren van biochemische tests, oxidase-test mannitol, gal-esculine en catalase-test. Alle isolaten zullen worden geïdentificeerd tot op soortniveau met behulp van het Vitek 2 compact systeem.

   2-5 Beoordeling van biochemie en moleculaire biologie: 16S Metagenomic Sequencing-analyse Whole genomic sequencing (WGS) zal op alle gevallen worden toegepast. De methodologie en kwaliteitscontrole zijn volgens het genomische en metagenomische centrum in het kinderkankerziekenhuis 57357, die de WGS- en 16S-sequencing op urine- en weefselmonsters.

1- DNA-isolatie uit urine en weefsel. Urinemonsters (50 ml) worden ontdooid en gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 7500 g, 4°C. De pellet zal worden gebruikt voor DNA-extractie met behulp van de Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit, uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. Om omgevingsverontreiniging te voorkomen, zullen alle isolaties van urinemonsters en van de extractiecontrole met alleen reagens worden uitgevoerd in een PCR-kap. Geïsoleerde DNA-monsters worden tot PCR-amplificatie bij -20 °C geplaatst. DNA zal worden gekwantificeerd met behulp van de DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Illumina 2013).

2- Op PCR gebaseerde KABA KAPA-bibliotheekkwantificatiekits bevatten alle reagentia die nodig zijn voor de nauwkeurige, betrouwbare en reproduceerbare op qPCR gebaseerde kwantificering van sequencing-bibliotheken (NGS) van de volgende generatie die zijn voorbereid voor sequencing op Illumina-platforms. Kits omvatten KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (geformuleerd met verschillende passieve referentiekleurstoffen voor verschillende qPCR-instrumenten), een platformspecifieke bibliotheekkwantificeringsprimer-premix en een vooraf verdunde set DNA-standaarden.

Het 16S rRNA-gen V3-V4-gebied zal worden geamplificeerd met fusieprimers die Illumina-adapters en indexeringsbarcodes bevatten. De PCR-stap voegt Index 1 (i7) en Index 2 (i5), sequencing en gemeenschappelijke adapters (P5 en P7) toe die nodig zijn voor clustergeneratie en sequencing. Er zal hooggevoelige DNA-elektroforese met het Bioanalyzer-systeem worden uitgevoerd om de kwaliteitscontroleanalyse van de NGS-bibliotheek te verbeteren. Voorbereiding van 3-16S rRNA-genenbibliotheek en MiSeq-sequencing. PCR-amplificatie van 16S rDNA, sequencing en analyses zullen worden uitgevoerd door NGS Illumina MiSeq, gericht op het V3V4-gebied van bacteriën MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycli). 16S rRNA-genampliconsequencing (16S-analyse) wordt veel gebruikt om microbiota te analyseren met behulp van de volgende generatie sequencingtechnologieën. 16S-analysegegevens van de standaard V3-V4-primer (V34)-sets om het analyseprotocol voor de blaasmicrobiota te optimaliseren. 4- Bio-informatica en statistische analyses. Het geannoteerde genoom wordt verder geanalyseerd met behulp van bioinformatische pijplijnen om inzicht te krijgen in de biologie van de ziekteverwekker en het potentieel om ziekten te veroorzaken. Het bevat:

- Kwaliteitscontrole en verbetering van het conceptgenoom door het verwijderen van fouten en het opvullen van lacunes.

• Annotatie van het uiteindelijke genoom, inclusief het identificeren en beschrijven van de functies van genen en andere kenmerken.
• Vergelijkende genomica, waarbij het nieuw gesequenced genoom wordt vergeleken met dat van verwante pathogenen om verschillen en overeenkomsten te identificeren.
• Functionele analyse: dit omvat het identificeren van de functies van de geannoteerde genen en het begrijpen van de routes en processen waaraan ze deelnemen. Dit kan belangrijke virulentiefactoren aan het licht brengen en helpen het pathogenesemechanisme van de ziekteverwekker te begrijpen.
• Fylogenetische analyse: hierbij wordt het nieuw gesequenced genoom vergeleken met dat van
• gerelateerde pathogenen om evolutionaire relaties te bepalen en de verspreiding van pathogenen in verschillende populaties te volgen.
• Verschillen in de algehele microbiële samenstelling tussen blaaskanker en gezond

• monsters zullen worden beoordeeld. NGS is niet beschikbaar in TBRI, de 16S-sequencing en bio-informatica zullen betaald worden gedaan in Kinderziekenhuis 57357 (ze zijn welkom om de sequencing uit te voeren volgens een "Betaald" principe).

  16S ribosomaal RNA (rRNA) Sequencing-analyse

  1. DNA-isolatie uit urine en weefsel. Urinemonsters (50 ml) worden ontdooid en gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 7500 g, 4°C. De pellet zal worden gebruikt voor DNA-extractie met behulp van de microbiome DNA Purification Kit. Om omgevingsverontreiniging te voorkomen, zullen alle isolaties van urinemonsters en van de extractiecontrole met alleen reagens worden uitgevoerd in een PCR-kap. Geïsoleerde DNA-monsters worden tot PCR-amplificatie bij -20 °C geplaatst. DNA zal worden gekwantificeerd met behulp van een assaykit (Illumina 2013).
  2. Op PCR gebaseerde KABA KAPA-bibliotheekkwantificatiekits bevatten alle reagentia die nodig zijn voor de nauwkeurige, betrouwbare en reproduceerbare op qPCR gebaseerde kwantificering van sequencing-bibliotheken (NGS) van de volgende generatie die zijn voorbereid voor sequencing op Illumina-platforms. Een platformspecifieke primer-premix voor bibliotheekkwantificatie en een vooraf verdunde set DNA-standaarden.

  16S rRNA hypervariabele regio'sV1V2 en V3-V4 regio zullen worden geamplificeerd met fusieprimers die Illumina-adapters en indexeringsbarcodes bevatten.

Er zal hooggevoelige DNA-elektroforese met het Bioanalyzer-systeem worden uitgevoerd om de kwaliteitscontroleanalyse van de NGS-bibliotheek te verbeteren.

Voorbereiding van 3-16S rRNA-genenbibliotheek en MiSeq-sequencing. PCR-amplificatie van 16S-rRNA, sequencing en analyses zullen worden uitgevoerd door NGS Illumina, gericht op de V1-V2- en V3-V4-regio. 16S rRNA-genampliconsequencing (16S-analyse) zal worden gebruikt om microbiota te analyseren met behulp van de volgende generatie sequencingtechnologieën. 16S-analysegegevens van de standaard V1-V2, V3-V4-primersets om het analyseprotocol voor de blaasmicrobiota te optimaliseren.

4- Bio-informatica en statistische analyses. Het geannoteerde genoom wordt verder geanalyseerd met behulp van bioinformatische pijplijnen om inzicht te krijgen in de biologie van de ziekteverwekker en het potentieel om ziekten te veroorzaken.

Referenties

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. Het urinemicrobioom geassocieerd met blaaskanker. Sci Rep. 2018 14 augustus;8(1):12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Wishahi, M., Otto, T. & Golka, K. Re: blaascarcinomen bij patiënten met neurogene blaas- en urinaire schistosomiasis - zijn het dezelfde tumoren? Wereld J Urol 40, 2139-2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R, Murata M, Ma N, Hammam O, Wishahi M, El Leithy T, Hiraku Y, Oikawa S, Kawanishi S (2012) Nucleaire lokalisatie van COX-2 in relatie tot de expressie van stemness-markers bij urineblaaskanker. Mediat Inflamm 2012:165879 2012;2012:165879. doi: 10.1155/2012/165879.
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) Blaascarcinomen bij patiënten met neurogene blaas- en urinaire schistosomiasis: zijn het dezelfde tumoren? Wereld J Urol. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O, Wishahi M, Khalil H, El Ganzouri H, Badawy M, Elkhquly A, Elesaily K (2014) Expressie van cytokeratine 7, 20, 14 bij urotheelcarcinoom en plaveiselcelcarcinoom van de Egyptische urineblaaskanker. J Egypte Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Zitvogel L, Daillère R, Roberti MP, Routy B, Kroemer G. Antikankereffecten van het microbioom en zijn producten. Nat. Rev. Microbiol. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, Reid G, Burton JP. Het microbioom van de urinewegen: een rol die verder gaat dan infectie. Nat. Ds. Urol. 2015;12:81-90. doi: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Xu W, et al. Mini-review: perspectief van het microbioom in de pathogenese van urotheelcarcinoom. Ben. J. Clin. Uitv. Urol. 2014;2:57-61.
9. Brubaker, L., Gourdine, J.-P. F., Siddiqui, N.Y., Holland, A., Halverson, T., Limeria, R., et al. (2021a). Consensus vormen om het onderzoek naar het urobioom te bevorderen. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Brubaker, L., Putonti, C., Dong, Q., en Wolfe, AJ (2021b). Het menselijke urobioom. Mam. Genoom 32, 232-238. doi: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Carrasco, V., Soriano-Lerma, A., Soriano, M., J., en Garcia-Salcedo, J.A. (2021). Urinemicrobioom: Yin en Yang van de urinewegen. Voorkant. Cel. Infecteren. Microbiol. 11. doi: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43. Wu N, et al. Dysbiose-signatuur van fecale microbiota bij patiënten met colorectale kanker. Microb. Ecol. 2013;66:462-470. doi: 10.1007/s00248-013-0245-9.